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人血管内皮生长因子及其受体Flt-1功能域在巴氏毕赤酵母中的表达和生物学活性的研究

血管内皮生长因子(vascular endothelium growth factor,VEGF)是血管内皮细胞的特异丝裂原,具有促进血管内皮细胞增殖,加速新血管形成的作用。VEGF是通过与血管内皮细胞表面的特异性受体结合而发挥其生物学效应的,在胚胎发育和心血管、肿瘤等疾病的发病和防治中具有重要作用。本文着重从以下三个方面对VEGF及其受体Flt-1进行了研究。一、人血管内皮生长因子VEGF_(165)在Pichia.pastoris中的表达、纯化及其生物学活性检测利用PCR技术,从phVEGF_(165)·SR真核表达质粒扩增出hVEGF_(165) cDNA,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/hVEGF_(165),分别用单交换和双交换的方法将目的基因整合到两种宿主菌GS115和KM71的染色体上。鉴定转化子表型(His~+Mut~s和His~+Mut~+),G418加压筛选多拷贝整合菌株,经甲醇诱导在Pichia.pas  (本文共103页) 本文目录 | 阅读全文>>

《中国免疫学杂志》2001年02期
中国免疫学杂志

人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外区2-3loop在Pichia.pastoris酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

血管内皮生长因子 (Vascularendothelialgrowthfactor ,VEGF)受体Flt 1属于酪氨酸蛋白激酶受体家族第 3亚型 ,分为胞外区、跨膜区和胞内区 3个部分[1] ,其中胞外区负责与配体结合 ,具有 7个免疫球蛋白样的袢 (Ig likeloop) ,配体结合域位于氨基端 3个loop内[2 ] ,其中第 2个loop在Flt 1与其配体的结合中起关键作用[3 ] 。由于VEGF具有促血管内皮细胞增殖及促新生血管形成的功能 ,在肿瘤及糖尿病性视网膜病变等血管生成相关疾病的发病过程中起重要作用 ,可通过拮抗VEGF的作用来治疗这些疾病。可溶性Flt 1受体通过与血管内皮细胞表面的受体竞争结合VEGF ,阻断其生物学活性 ,抑制肿瘤的生长和转移及视网膜新生血管形成 ,具有潜在的临床药用开发价值。为了寻求能与配体结合的更小的Flt 1片段 ,我们利用PCR技术 ,从人胎盘cDNA文库中扩增出 62 1bp...  (本文共5页) 阅读全文>>

《生物技术通报》2015年09期
生物技术通报

重组人白细胞介素-1α在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性检测

1972年,Gery等从人白细胞的培养上清中提取得到一种可溶性物质,起初被命名为淋巴细胞激活因子或内源性热原质、破骨细胞刺激因子、黑素瘤细胞生长抑制因子等,在1979年被统一命名为白细胞介素-1(IL-1)[1]。IL-1按其结构不同分为IL-1α和IL-1β。IL-1α基因定位于2号染色体,含7个外显子,IL-1α的前体是由IL-1α基因合成的、无信号肽的31 k D分子。IL-1α前体被Ca2+依赖的钙蛋白激酶降解为17 k D的成熟体,等电点为5.3,IL-1β是由153个氨基酸以β-折叠的形式组成位于2号染色体,分子量约为17.5 k D,等电点为7.2。IL-1α和β在同一种属中两者的同源性只有20%-30%,但在不同种属间具有较高同源性,分别为60%-70%和75%-78%[2,3]。IL-1α具有很重要的研究意义和应用价值,文献报道IL-1α在白血病、肝癌、黑色素瘤、胃癌等在内的多种肿瘤中均有表达[4-6],而其表...  (本文共7页) 阅读全文>>

《细胞与分子免疫学杂志》2001年01期
细胞与分子免疫学杂志

VEGF_(165)cDNA在酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

人血管内皮生长因子VEGF;6。是由165个氨基酸组成的糖蛋白,其分子内有3对二硫键和互个糖基化位点。二硫键对维持其三级结构起重要作用,而糖基化仅与分泌功能有关”]。VEGF作为一种高特异性促血管内皮细胞生长因子,在心血管领域已被用于冠心病防治的实验研究。发现其可促进小冠状血管侧枝循环的建立,恢复心肌血流供应,减少梗塞面积,促进缺血心肌的功能恢复,而且对实验性动脉成形术后再狭窄也具有很好的防治作用。因此,研制、开发重组VEGF,对于缺血性心脏病及其它组织缺血性疾病的防治具有重大的应用价值。 VEGF由于天然来源非常有限、产量甚微,远不能满足临床应用的需要,因此,利用DNA重组技术大量生产VEGF势在必行。我们在大肠杆菌中高效表达了hVEGF165,但其以不溶解、无活性的包涵体形式存在,使其纯化和复性困难。在哺乳动物细胞中也表达了hVEGF165,但表达量很低。甲基营养型酵母表达系统作为一种新型外源基因的表达系统,兼有原核细胞良好...  (本文共5页) 阅读全文>>

《生物工程学报》2000年04期
生物工程学报

人血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区cDNA在毕赤酵母中的表达和鉴定

血管内皮细胞生长因子 (VEGF)受体Flt 1属酪氨酸蛋白激酶受体家族第三亚型 ,是分子量约为180kD的糖蛋白[1] ,分为胞外区、跨膜区和胞内区三个部分 ,其中胞外区负责与配体结合 ,具有 7个免疫球蛋白样袢 (Ig likeloop) ,配体结合域位于氨基端 3个loop内[2 ] 。由于VEGF具有促血管内皮细胞增殖及促新生血管形成的功能 ,在肿瘤及糖尿病性视网膜病变等血管生成相关疾病的发病过程中起重要作用 ,可通过拮抗VEGF的作用来治疗这些疾病。可溶性受体sFlt 1通过与血管内皮细胞表面的受体竞争结合VEGF ,阻断其生物学活性 ,抑制肿瘤的生长和转移及视网膜新生血管形成 ,具有潜在的临床药用开发价值。甲基营养型酵母表达系统是一种新型外源基因表达系统 ,兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的翻译后加工的双重特点[3] 。我们利用PCR技术 ,从人心肌细胞cDNA文库中扩增出 94 8bp的Flt 1胞外 1~ 3...  (本文共4页) 阅读全文>>

《中华微生物学和免疫学杂志》2001年04期
中华微生物学和免疫学杂志

人血管内皮生长因子受体胞外1-3、2-3 loop cDNA在酵母中的表达及其生物学活性研究

血管内皮生长因子 (VEGF)具有促血管内皮细胞增殖及促新生血管形成的功能 ,在肿瘤及糖尿病性视网膜病变等血管生成相关疾病的发病过程中起重要作用 ,可通过拮抗VEGF的作用来治疗这些疾病。可溶性受体sFLT 1通过与血管内皮细胞表面的受体竞争结合VEGF ,阻断其生物学活性 ,抑制肿瘤的生长和转移及视网膜新生血管形成 ,具有潜在的临床药用开发价值〔1 3〕。为了寻求能与配体结合的更小的FLT 1片段 ,我们构建酵母重组表达质粒pPIC9K/FLT 1( 1 3)及pPIC9K/FLT 1( 2 3) ,并在毕赤巴斯德酵母 (Pichiapastoris)中获得高效表达 ,经CM SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS 10 0分子筛层析纯化。在得到较高纯度可溶性受体的基础上 ,对其生物学活性进行了研究 ,比较了sFLT 1( 1 3)和sFLT 1( 2 3)与hVEGF165的结合能力及它们对hVEGF...  (本文共4页) 阅读全文>>