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成年体细胞克隆山羊研究

1.比较了切剖法和抽吸法从屠宰山羊卵巢表面卵泡采集得到的可用卵母细胞数。实验切剖了4201个卵巢,平均采集可用卵母细胞数4.95枚/卵巢(20794枚/4201卵巢)。用抽吸法抽取了360个卵巢,平均采集可用卵母细胞数为2.86枚/卵巢(1029枚/360卵巢)。结果表明两种采集方法采集的可用卵母细胞数差异显著。用切剖法采集不同季节屠宰的山羊卵巢卵母细胞,结果繁殖季节(10-1月)卵巢可采集到可用卵母细胞4.50枚/卵巢(3160枚/702卵巢),非繁殖季节(3-6月)卵巢可采集到可用卵母细胞5.17枚/卵巢(3134/607)。不同季节采集的卵母细胞数差异显著。结果表明非繁殖季节屠宰的山羊卵巢可采集到更多的可用卵母细胞。2.将繁殖季节采集的3286枚卵丘-卵母细胞复合体用于体外成熟,成熟率为67.7%(2223/3286)。非繁殖季节采集的卵巢卵丘-卵母细胞复合体3295枚,成熟率74.1%(2440/3295)。结果表明不同  (本文共143页) 本文目录 | 阅读全文>>

南京农业大学
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转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究

人溶酶体β-葡萄糖苷酶(human lysosomal acidβ-glucosidase, GlcCerase)是糖蛋白降解途径的主要外糖苷酶,参与糖蛋白的回收利用。该酶减少或缺失会导致葡萄糖脑苷脂不能有效降解,在各器官中大量沉积,从而使机体发生广泛的病理变化,临床上称为“戈谢病”,酶替代法是目前该病的主要疗法。人体来源的GlcCerase获得极为困难,应用哺乳动物细胞和转基因植物表达系统生产重组人GlcCerase虽然已经有一些成功的报道,但也面临许多难以克服的问题,如在CHO细胞表达重组人GlcCerase,生产成本过于昂贵;在转基因植物中表达,存在重组蛋白质中糖链结构的改变以及下游加工处理困难等限制。如果应用转基因动物乳腺生物反应器生产重组人GlcCerase,在得到天然活性较高产品的同时,将极大地降低生产成本,具有其它表达系统所不能代替的优势。然而,显微注射法的高成本、低效率长期以来制约着转基因动物研究的发展,体细胞转...  (本文共167页) 本文目录 | 阅读全文>>

西南大学
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CD320和RanBP9在山羊精原干细胞中的表达研究

精子介导转基因方法(sperm-mediated gene transfer,SMGT)是生产转基因动物的有效途径,具有简便、高效特点,但机制至今不明确。我们前期研究证明CD4分子在山羊精子内化外源DNA的过程中起主要作用,并利用酵母双杂交系统,筛选与CD4相互作用的新型侯选分子—CD320和RanBP9,且通过免疫共沉淀方法初步验证了CD4与CD320和RanBP9具有相互作用,同时证明CD320和RanBP9在睾丸中的表达水平较高。但这两个分子在精子转染外源DNA的作用研究仍是空白。由于动物精子是精子细胞经过变态、高度分化形成的一类细胞,不具有分裂增殖的能力,不利于基因功能的研究。因此,我们将研究对象转向了与精子有密切关系的精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)。SSCs是性别分化后,精子发生的最初细胞形式,是精子生成和雄性生育能力的基础,具有自我更新维持生殖细胞数量恒定和定向分化产生精母...  (本文共81页) 本文目录 | 阅读全文>>

南京农业大学
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体细胞克隆山羊表观遗传修饰与基因表达特征研究

尽管体细胞核移植在许多物种中获得成功,但是获得表型正常克隆动物的效率却非常低。供体细胞核的不完全重序被认为是造成克隆胚胎不能正常发育到成年的首要原因。深入探讨成年体细胞克隆动物中潜在的表现遗传修饰机制,将有助于了解关于克隆动物能够正常发育的后成重序界限,强化SCNT中相关的伦理观念。本研究以成年体细胞克隆山羊为研究对象,运用同源扩增、PCR克隆测序方法获得山羊印迹基因差异甲基化(DMR)序列,并通过Southern杂交、实时定量RT-PCR、SSCP等技术,进一步探索了成年克隆山羊印迹基因、DNA重复序列的甲基化模式,端粒长度以及生长相关印迹基因和非印迹基因的表达特征,深入探讨甲基化对基因表达的调控模式。1.山羊H19/IGF2和IGF2R第2内含子DMR的克隆测序与分析本实验根据绵羊的DNA序列AJ566210保守区域设计引物扩增出山羊H19基因第一外显子上游长4.2kb的调控区域序列,经生物信息学分析,该序列具有和绵羊、人类...  (本文共158页) 本文目录 | 阅读全文>>

东北农业大学
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利用体细胞核移植技术生产转基因山羊的研究

动物转基因是目前生物领域的研究热点之一,其基本特征是改变了动物的遗传组成,使动物按照人们的意愿进行改造。以传统的原核显微注射法生产转基因动物的效率非常低下(成功率仅为3~5%),严重地制约了转基因动物研究进展。与之相比,体细胞克隆技术在生产转基因动物方面有着不可比拟的优越性。利用体细胞克隆技术生产转基因动物的优点是:转基因操作主要是集中在细胞水平上完成,从而极大地提高了生产效率、降低了生产成本和减少了工作强度;在体外可以监控转基因的表达水平,以便获得高效表达转基因动物;对基因进行定点修饰,促进生物医药、功能基因组等方面的研究。本实验以Myostatin基因为靶基因、含有新霉素抗性基因、绿色荧光蛋白基因、胸苷激酶、LoxP位点的双标记选择载体作为框架结构、羊胎儿成纤维细胞和成年耳部成纤维细胞系为转染细胞,测定了不同转染方法(磷酸钙法、脂质体法及电击法)的转染效果,筛选阳性细胞克隆,借助体细胞克隆技术生产转基因克隆胚胎。建立了一套完...  (本文共91页) 本文目录 | 阅读全文>>

西北农林科技大学
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大熊猫成纤维细胞体外培养与异质克隆胚构建

本项研究首先用山羊和牛的皮肤组织进行了细胞培养预备试验,对其细胞系建立方法和基本特性进行了探讨。在此基础上,成功建立了大熊猫皮肤成纤维细胞有限和无限细胞系,获得体外发育至囊胚的大熊猫-牛种间核移植胚胎。结果如下:一.用含有10%NCS、100IU/ml青霉素、10OIU/ml链霉素的M199 4℃保存皮肤组织,8小时内组织块均能存活。添加10%NCS、100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素的M199、DMEM、HLH培养液,均可用于山羊和牛的皮肤细胞的体外培养,其中青山羊皮肤组织块在上述培养液中原代培养的成活率分别为75.0%、71.4%和80.0%。用添加D-Hanks’配制的0.25%胰蛋白酶(trypsin),0.02%EDTA,胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶,0.02%EDTA,简称TE)消化液控时控温消化,重新接种后24小时的细胞贴壁率分别为86.4%、88.5%、95.8%。根据上皮细胞与成纤维细胞对...  (本文共115页) 本文目录 | 阅读全文>>