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植物抗病毒基因工程研究 Ⅰ黄瓜花叶病毒复制酶基因表达载体构建和遗传转化 Ⅱ导入病毒基因的转基因植物释放的风险评估

根据已发表的黄瓜花叶病毒(CMV)Fny RNA2基因序列,设计了全长的2a复制酶(Replicase)基因的特异引物,以CMV Fny RNA2 cDNA的克隆pFny209为模板,进行PCR扩增,得到全长2.5kb的2a复制酶基因扩增产物(RP)。对此产物进行纯化,并用NcoⅠ和BspHⅠ进行双酶切,得到三个片段。将不含有GDD保守区的两个片段用T4 DNA连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到2.2kb左右的缺失GDD保守区的CMV 2a复制酶基因扩增产物(RP△GDD)。以CMV P1 RNA2基因组为模板,根据CMV Fny RNA2基因组的发表序列设计引物,进行PCR扩增,得到5'端及3'端分别缺失的2a复制酶基因(P1-RP)。将三个不同长度的2a复制酶基因片断克隆到pGEM-T Easy Vector上,筛选获得重组质粒pTEVRP、pTEVRP△GDD和pTEVP1-RP。对重组质粒进行序列测定,结果表明  (本文共127页) 本文目录 | 阅读全文>>

《热带亚热带植物学报》2004年02期
热带亚热带植物学报

香蕉束顶病毒复制酶基因克隆及转基因表达

香蕉是我国南方主要水果之一,具有栽培容易、生产周期短、效益高等特点,是国内消费和出口创汇的一个重要资源。每年世界香蕉产量达7.6×107 t,但由于各种病害引起的损失约占总量的50%;其中以香蕉束顶病最为严重[1]。目前,广东香蕉束顶病发生率为10%-30%,表现为植株矮缩,不开花结蕾,严重影响香蕉生产。香蕉束顶病研究始于上世纪初,但至今对发病原因还未有统一的认识[1-3]。有人认为香蕉束顶病是由细菌、类菌原体引起[4];但多数研究工作证实香蕉束顶病毒(BBTV)主要借带病蘖芽和蕉脉蚜(Pentalonianigronervosa)传染[5,6]。BBTV的研究相对于香蕉花叶病毒而言进展较慢;其主要原因是未能找到该病毒的纯化方法。1990年Wu和Su[5]首先提出了BBTV的纯化方法,随后有关BBTV的特性、核苷酸组成和DNA序列以及香蕉束顶病防治等研究有了很大的进展[7-11]。在抗病毒植物基因工程方面,Zaitlin等人[1...  (本文共5页) 阅读全文>>

《生物化学与生物物理进展》1990年06期
生物化学与生物物理进展

复制酶体的瞻望和疑问

双链DNA分子的复制是一个复杂的过程,由许多酶组成的复合体参与此过程。具有这些酶活性的蛋白质不能独立起作用,它们都被包含在一个蛋白质复合体内,称为复制酶体(re-plitase)〔‘,或复制体(repxisome)。,。这种复制酶体并不象核糖体那样始终是一个游离的细泡内小体,而是在DNA复制开始时才由其各种成分装配而成。有确切证据表明原核生物中DNA复制是通过蛋白质复合体的作用与其前体的合成相协调的[3]。在噬菌体T4的复制中,10个或更多的酶组成的复合体催化UDP转化为dTTP和5径甲基dCTP。这个复合体还和噬菌体编码的DNA聚合酶、拓朴异构酶、基因32DNA一结合蛋白等相连在一起,故能将核糖核营酸有效地转变为DNAt’1。这方面的工作已有综述报道〔习,故本文不详述。本文的目的是讨论一个比较困难的问题,即真核细胞中的复制酶沐。有关复制酶体的概念,支持者和反对者均有证据。在真核细胞中,情况过于复杂,现在难以作出确切的结论;然而...  (本文共5页) 阅读全文>>

内蒙古大学
内蒙古大学

苜蓿花叶病毒复制酶基因不同片段介导的抗病性研究

本实验将苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AlMV)复制酶P_2亚基基因全长cDNA序列及3′端非编码区序列构建到植物双元表达载体pROKⅡ中,分别得到重组表达载体pROKAMVF、pROKAMV3N。在实验室前期工作中已将AlMV复制酶基因的5′端1/2cDNA序列、3′端1/2 cDNA序列分别构建到植物双元表达载体pROKⅡ中,得到重组植物表达载体pROKAMV5、pROKAMV3。将上述四种重组表达载体经农杆菌LBA4404介导转化烟草,获得相应的转化植株,进行PCR检测,结果证明目的基因已整合到烟草基因组中。pROKAMV5转化烟草获得24个转基因株系共90株植株;pROKAMV3转化烟草获得18个转基因株系共69株植株;pROKAMVF转化烟草获得4株转基因植株;pROKAMV3N转化烟草获3株转基因植株。AlMV接种后检测抗病性结果为:pROKAMV5转基因植株中10个株系对AlMV接种表现完...  (本文共45页) 本文目录 | 阅读全文>>

《病毒学报》2015年06期
病毒学报

基于复制酶基因序列的黄瓜绿斑驳花叶病毒系统进化及生物信息学分析

综合分析认为,供试CGMMV分离物复制酶基因序列相似性较高,种内稳定且保守,种间差异明显;CGMMV-No.1、CGMMV-No.3、CGMMV-No.4和CGMMV-No.5与中国山东、辽宁分离物的亲缘关系较近,可能具有相同的侵染来源,而CGMMV-No.2与韩国分离物的亲缘关系较近,序列相似性高的供试样品在系统发育树中聚为一类;供试CGMMV分离物129kD和57kD蛋白生物信息学分析结果不具规律性。黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottlemosaic virus,CGMMV)是一种世界范围的检疫性有害生物,属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员,是侵染葫芦科作物的重要病毒之一[1],严重危害我国大田瓜类作物的生产[2]。CGMMV的核酸为正单链线性RNA,基因组长度6.4kb左右[3-5],共包含4个开放阅读框(Openread frame,ORF),分别编码129kD、186kD、29kD...  (本文共9页) 阅读全文>>

《中国烟草学报》1998年01期
中国烟草学报

转复制酶基因抗病毒烟草的研究

植物病毒病害一直是影响农业生产的一个大问题,由于病毒的浸染,造成农作物减产、品质变劣,导致严重的经济损失。利用植物基因工程方法将抗病毒基因转入植物以获得抗病毒的工程植株是一种具有广阔应用前景的育种方法。1985年,Bevan”’将TMV外壳蛋白基因导入植物中使其得到表达。此后,已有黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus,CMV),马铃薯病毒X(potatovirusXPVX),首稽花叶病毒(Alfalfamosaicvirus,ALMV)等数十种病毒的外壳蛋白基因在受体植物中得到表达并获得相应的抗性。1990年,Golemboski‘”等将TMVUI株的复制酶组分54KD蛋白编码序列导入烟草获得的转基因植株能完全抵抗TMVUI株系和亲缘关系相近的YSI/l突变株的侵染,此后进一步发现表达病毒复制酶组分的抗性途径明显优于外壳蛋白介导的抗性途径。转入病毒复制酶组分的抗性植株,其抗性水平与整合到染色体上的基因拷贝数、基因...  (本文共4页) 阅读全文>>