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GDNF基因治疗大鼠脊髓损伤实验研究

本研究通过克隆大鼠 GDNF cDNA,并将其与真核表达载体 pEGFP-C3相连接,在国内外首次构建了大鼠在体转基因重组质粒pEGFP-GDNF,利用EGFP的发光性,为GDNF基因转染后在活体细胞中表达的动态观察建立了新的报告基因。借助多价阳离子脂质体DC-Chol 介导,在国内外首次成功的将pEGFP-GDNF基因导入正常大鼠中胸段脊髓组织中并得到良好表达。由于GDNF的 N端缺失11个氨基酸残基后并不影响 GDNF的神经营养活性。本实验设计将EGFP基因融合在GDNF基因的5’端,并且两者之间以编码柔软肽段的核昔酸连接以保持EGFP与GDNF各自的活性。这样既保留了GDNF蛋白的神经营养活性,又能通过EGFP观察GDNF蛋白在体内的表达。本研究首次发现在大鼠急性脊髓重度压迫损伤后经蛛网膜下腔局部给予 GDNF蛋白 10μg/日能减少胶质细胞增生,促进脊髓损伤区大鼠皮质脊髓束轴突再生和神经骨架蛋白的修复,并能有效促进损伤大  (本文共105页) 本文目录 | 阅读全文>>

苏州大学
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rAAV2介导GDNF联合早期康复训练治疗大鼠脊髓损伤的实验研究

研究目的:本实验以雄性SD大鼠为研究对象,造模后应用rAAV2介导GDNF联合早期康复训练对脊髓损伤的大鼠进行实验研究,采用运动学评分、组织形态学和免疫组化等技术,通过分析脊髓损伤大鼠在不同时间点后肢运动功能的变化、损伤脊髓处GDNF的蛋白表达、运动神经元形态和数量的变化等,比较早期康复训练、基因治疗以及这两种因素的联合作用对脊髓损伤大鼠恢复的影响。研究方法:本实验采用了rAAV2介导GDNF基因治疗、早期康复训练及两者联合三种方法对脊髓重物打击造模后的大鼠进行干预:雄性SD大鼠90只,随机分为假手术组(n=18)、自然愈合组(n=18)、基因治疗组(n=18)、康复训练组(n=18)、联合治疗组(n=18),其中每组按照取材时间点不同随机分为造模后7d组(n=6)、14d组(n=6)、21d组(n=6)。对基因治疗组、联合治疗组大鼠造模成功后24h注射携带有人GDNF基因的重组腺相关病毒。对康复训练组、联合治疗组大鼠在造模成功...  (本文共66页) 本文目录 | 阅读全文>>

吉林大学
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壳聚糖纳米粒子胶质细胞源性神经营养因子基因复合体在脊髓损伤中应用的实验研究

目的:构建GDNF真核表达载体,制备壳聚糖纳米粒子,研究壳聚糖纳米粒子载GDNF基因在脊髓继发性损伤中的作用,为治疗脊髓损伤寻找新的途径。方法:首先应用RT-PCR、基因测序、分子克隆获得pcDNA3.1/GDNF质粒。同时制备壳聚糖纳米粒子,并对壳聚糖纳米粒子作为基因载体的相关性能进行检测。在体外实验中,壳聚糖纳米粒子载质粒GDNF基因从细胞外转入胶质细胞内,并在细胞内表达GDNF蛋白,进行细胞免疫化学,细胞增殖试验,流式细胞仪以及Westernblot检测;在体内实验中,首先制作脊髓损伤模型,将壳聚糖纳米粒子GDNF基因复合体(CS-nano/pcDNA3.1/GDNF)转入损伤的脊髓,应用免疫组化、实时RT-PCR半定量技术检测GDNF的表达,并进行细胞凋亡检测(TUNEL法)。结果:(1)成功构建大鼠GDNF真核表达载体;(2)制备壳聚糖纳米粒子,壳聚糖性能稳定,对GDNF有很好的保护作用;(3)体外实验中,壳聚糖纳米粒...  (本文共139页) 本文目录 | 阅读全文>>

吉林大学
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GDNF基因修饰的雪旺细胞对大鼠脊髓损伤保护作用的实验研究

脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)是外科常见的创伤性疾病,由于创伤后运动神经元的变性和轴突的断裂、降解而导致神经退行性改变或者运动功能的障碍。脊髓损伤后的神经修复一直是困扰医学界的难题。随着分子生物学的发展,基因治疗成为SCI治疗的重要手段之一,其疗效主要决定于目的基因和载体系统的选择。由于雪旺细胞(Schwann cells,SCs)易于获得和培养,植入宿主后能在宿主体内长期存活并能继续分裂,这些特性使其具有更广阔的应用前景。本研究旨在体外分离培养SCs,利用分子生物学技术,将胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotropic factor,GDNF)一种对神经元的发育、分化和存活具有重要作用的神经营养因子,通过脂质体导入SCs,观察其对脊髓神经元细胞凋亡基因的调控作用进而初步阐述其促进脊髓损伤的修复作用的机制,结果显示:在体外成功分离和鉴定得到的高纯度的S...  (本文共96页) 本文目录 | 阅读全文>>

浙江大学
浙江大学

HIF-1α基因及GDNF基因修饰神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的研究

研究目的:探讨经HIF-1α、 GDNF基因修饰的神经干细胞(NSCs)在大鼠脊髓内移植后,神经干细胞的存活和分化情况及其对动物运动功能恢复的影响。为脊髓损伤的基因治疗提供新思路及实验依据。研究方法:采用电控大鼠脊髓损伤打击装置制作SD大鼠脊髓损伤模型95只,25g·c(2.5cm×10g)力致伤T13脊髓,随机分为4组:正常对照(Normal)5只,脊髓损伤组(SCI)30只,神经干细胞移植组(NSC)30只, HIF-1α、GDNF双基因修饰的神经干细胞移植组(HIF-1α、GDNF+NSC)30只,分别于移植后5个时相点(1周、2周、3周、5周、8周)对大鼠进行BBB后肢功能评分和皮层体感诱发电位(cortical somatosensory evoked potential, CSEP)检查后,进行灌注固定,取损伤段脊髓做石蜡切片,运用HE染色、免疫组化、免疫双标检测等方法,通过观察移植处神经干细胞的标记物5-溴-2-脱...  (本文共95页) 本文目录 | 阅读全文>>

苏州大学
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GDNF基因转染大鼠间充质干细胞修复脊髓神经损伤的实验研究

目的:探讨大鼠源性胎盘来源间充质干细胞(PMSCs)和骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)的培养方法并进行鉴定,将胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)转染PMSCs和BMSCs,并研究两种细胞转染后的生物学特性。比较转染GDNF基因的胎盘间充质干细胞和骨髓间充质干细胞修复脊髓神经损伤的疗效。为将PMSCs应用于脊髓神经损伤的修复提供实验基础。方法:采用密度梯度离心的方法将PMSCs从SD大鼠的胎盘中分离出来,并在体外传代、纯化、扩增,BMSCs从SD大鼠的股骨骨髓中分离出来进行培养。对比观察两种细胞的细胞形态。检测细胞表面标志物CD29、CD90、CD34、CD45。以GDNF过表达慢病毒感染BMSCs和PMSCs,观察观察绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的表达情况。以MTT法检测转染GDNF基因的PMSCs与BMSCs的细胞活力,Western blot检测转染后GDNF在PMSCs和...  (本文共63页) 本文目录 | 阅读全文>>