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GDNF基因治疗大鼠脊髓损伤实验研究

本研究通过克隆大鼠 GDNF cDNA,并将其与真核表达载体 pEGFP-C3相连接,在国内外首次构建了大鼠在体转基因重组质粒pEGFP-GDNF,利用EGFP的发光性,为GDNF基因转染后在活体细胞中表达的动态观察建立了新的报告基因。借助多价阳离子脂质体DC-Chol 介导,在国内外首次成功的将pEGFP-GDNF基因导入正常大鼠中胸段脊髓组织中并得到良好表达。由于GDNF的 N端缺失11个氨基酸残基后并不影响 GDNF的神经营养活性。本实验设计将EGFP基因融合在GDNF基因的5’端,并且两者之间以编码柔软肽段的核昔酸连接以保持EGFP与GDNF各自的活性。这样既保留了GDNF蛋白的神经营养活性,又能通过EGFP观察GDNF蛋白在体内的表达。本研究首次发现在大鼠急性脊髓重度压迫损伤后经蛛网膜下腔局部给予 GDNF蛋白 10μg/日能减少胶质细胞增生,促进脊髓损伤区大鼠皮质脊髓束轴突再生和神经骨架蛋白的修复,并能有效促进损伤大  (本文共105页) 本文目录 | 阅读全文>>

吉林大学
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壳聚糖纳米粒子胶质细胞源性神经营养因子基因复合体在脊髓损伤中应用的实验研究

目的:构建GDNF真核表达载体,制备壳聚糖纳米粒子,研究壳聚糖纳米粒子载GDNF基因在脊髓继发性损伤中的作用,为治疗脊髓损伤寻找新的途径。方法:首先应用RT-PCR、基因测序、分子克隆获得pcDNA3.1/GDNF质粒。同时制备壳聚糖纳米粒子,并对壳聚糖纳米粒子作为基因载体的相关性能进行检测。在体外实验中,壳聚糖纳米粒子载质粒GDNF基因从细胞外转入胶质细胞内,并在细胞内表达GDNF蛋白,进行细胞免疫化学,细胞增殖试验,流式细胞仪以及Westernblot检测;在体内实验中,首先制作脊髓损伤模型,将壳聚糖纳米粒子GDNF基因复合体(CS-nano/pcDNA3.1/GDNF)转入损伤的脊髓,应用免疫组化、实时RT-PCR半定量技术检测GDNF的表达,并进行细胞凋亡检测(TUNEL法)。结果:(1)成功构建大鼠GDNF真核表达载体;(2)制备壳聚糖纳米粒子,壳聚糖性能稳定,对GDNF有很好的保护作用;(3)体外实验中,壳聚糖纳米粒...  (本文共139页) 本文目录 | 阅读全文>>

吉林大学
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GDNF基因修饰的雪旺细胞对大鼠脊髓损伤保护作用的实验研究

脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)是外科常见的创伤性疾病,由于创伤后运动神经元的变性和轴突的断裂、降解而导致神经退行性改变或者运动功能的障碍。脊髓损伤后的神经修复一直是困扰医学界的难题。随着分子生物学的发展,基因治疗成为SCI治疗的重要手段之一,其疗效主要决定于目的基因和载体系统的选择。由于雪旺细胞(Schwann cells,SCs)易于获得和培养,植入宿主后能在宿主体内长期存活并能继续分裂,这些特性使其具有更广阔的应用前景。本研究旨在体外分离培养SCs,利用分子生物学技术,将胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotropic factor,GDNF)一种对神经元的发育、分化和存活具有重要作用的神经营养因子,通过脂质体导入SCs,观察其对脊髓神经元细胞凋亡基因的调控作用进而初步阐述其促进脊髓损伤的修复作用的机制,结果显示:在体外成功分离和鉴定得到的高纯度的S...  (本文共96页) 本文目录 | 阅读全文>>

河北医科大学
河北医科大学

脊髓损伤的基础及腺病毒介导的胶质细胞源性神经营养因子转染促进脊髓损伤后神经功能恢复的实验研究

脊髓损伤治疗的实验研究一直是神经科及骨科的研究热点。脊髓原发损伤取决于致伤暴力大小和脊髓移位程度,而骨块、韧带的移位及椎管内血肿则造成脊髓持续受压,进而加重脊髓继发损伤。目前的研究表明,由继发损伤造成的脊髓损害远远超过了机械形变造成的损伤,及时有效地解除脊髓压迫可以减轻继发损伤,对于保护神经功能有重要作用。但是目前脊髓压迫时间与神经功能损伤的关系尚不明了,何时为手术最佳时期仍无一致意见。随着基础科学研究的不断深入,人们认识到治疗的效果依赖于对神经元的保护作用和促进轴突的再生。给予外源性神经营养因子能够保护神经元、促进轴突的再生。但由于外源性神经营养因子相对分子质量较大,不能透过血脑屏障,且半衰期短一直无法应用于临床。基因治疗SCI 是一种新型的治疗方法,通过转基因技术可使被转染的细胞不断分泌所需营养因子,保护神经元、促进轴突再生和神经功能恢复,能起到长期的效果。在目前已知的神经营养因子中,GDNF 是活性最强的运动神经营养因子。...  (本文共136页) 本文目录 | 阅读全文>>

苏州大学
苏州大学

rAAV2介导GDNF联合早期康复训练治疗大鼠脊髓损伤的实验研究

研究目的:本实验以雄性SD大鼠为研究对象,造模后应用rAAV2介导GDNF联合早期康复训练对脊髓损伤的大鼠进行实验研究,采用运动学评分、组织形态学和免疫组化等技术,通过分析脊髓损伤大鼠在不同时间点后肢运动功能的变化、损伤脊髓处GDNF的蛋白表达、运动神经元形态和数量的变化等,比较早期康复训练、基因治疗以及这两种因素的联合作用对脊髓损伤大鼠恢复的影响。研究方法:本实验采用了rAAV2介导GDNF基因治疗、早期康复训练及两者联合三种方法对脊髓重物打击造模后的大鼠进行干预:雄性SD大鼠90只,随机分为假手术组(n=18)、自然愈合组(n=18)、基因治疗组(n=18)、康复训练组(n=18)、联合治疗组(n=18),其中每组按照取材时间点不同随机分为造模后7d组(n=6)、14d组(n=6)、21d组(n=6)。对基因治疗组、联合治疗组大鼠造模成功后24h注射携带有人GDNF基因的重组腺相关病毒。对康复训练组、联合治疗组大鼠在造模成功...  (本文共66页) 本文目录 | 阅读全文>>

苏州大学
苏州大学

表达GDNF的骨髓基质干细胞治疗帕金森病的实验研究

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是60岁以上患者高发的一种神经系统变性疾病,其主要特征是由于黑质纹状体多巴胺(DA)神经元缺失,临床表现为运动徐缓、静止性震颤、齿轮样强直等症状。但目前仍没有有效的方法中止和延缓黑质多巴胺神经元的进行性病变。近年来,PD的治疗的研究发展迅速,方法也是多种多样,基因治疗已进入临床实验。由于表达稳定、表达时程长,干细胞介导的基因治疗已成为目前研究的热点,因此,本文对应用表达GDNF的骨髓基质干细胞治疗帕金森病进行了初步研究。细胞介导的基因治疗的疗效取决于两个方面,即目的基因和载体细胞。根据文献报道,我们选择胶质细胞源性神经营养因子(glial cell linederived neurotrophic factor,GDNF)为目的基因。GDNF是中脑多巴胺神经元的神经营养因子,也是TGF-βs超家族中的一员,被认为是目前保护多巴胺能神经元最有效的神经生长因子,以往的实验表明G...  (本文共85页) 本文目录 | 阅读全文>>

四川大学
四川大学

ChABC、GDNF、Nogo-A抗体联合应用促损伤脊髓再生修复实验研究

目的:1.体外评价确定Nogo-A抗体是否能中和抑制性抗原的抑制作用2.探讨ChABC、GDNF及Nogo-A抗体联合应用对大鼠脊髓完全性横断伤后脊髓再生修复及功能恢复的影响。方法:1.3T3成纤维细胞扩展评价:成纤维细胞扩展在CNS髓磷脂或富含Nogo-A的蛋白提取液包被的培养皿中被强烈抑制。当用能与该抗原结合并中和其抑制活性的抗体后,3T3细胞的扩展得到较大程度的恢复。2.采用大鼠胸段(T7—8)脊髓完全横切损伤模型,将SD大鼠随机分为10组:正常组(n=6)、假手术组(n=6)、单纯横断组(n=10)、A(ChABC n=10)组、G(GDNF n=10)组、N(Nogo-A抗体n=10)组、AG(ChABC+GDNF n=10)组、AN(ChABC+Nogo-A抗体n=10)组、GN(GDNF+Nogo-A抗体n=10)组、AGN(ChABC+GDNF+Nogo-A抗体n=10)组。正常组:不进行任何干预处理;假手术组:...  (本文共142页) 本文目录 | 阅读全文>>