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猪瘟病毒E2基因遗传变异及体外表达研究

针对频繁出现的弱毒疫苗免疫失败现象和免疫猪群持续带毒等猪瘟(CSF)防制中的重大问题,本项研究从病毒的分子水平入手,试图从病毒分子变异水平以及当前流行毒的分子差异程度澄清原因,并针对CSF的持续感染研制出高效安全的基因工程标记疫苗和诊断试剂,为彻底消灭CSF提供科学依据和技术支撑。主要研究内容包括:1.猪瘟病毒主要免疫原E2基因的序列分析:利用反转录PCR(RT-PCR)及套式PCR(nPCR)方法扩增了中国猪瘟兔化弱毒株(C株)兔脾组织毒保护性抗原E2(gp55)基因,成功地将其克隆并测定核苷酸序列,与国内外已发表的猪瘟病毒(CSFV)E2基因序列比较的结果是:C-株兔脾毒与C-株细胞(SK6)毒、C-株疫苗(犊牛睾丸细胞,CSFV-C)毒CSFV-SM株(石门)毒、Bresia株(荷兰)毒、Alfort株(德国)毒的E2核苷酸序列同源性分别为98.87%、98.34%、94.58%、91.00%、80.78%;氨基酸同源性分  (本文共141页) 本文目录 | 阅读全文>>

西北农林科技大学
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抗猪瘟病毒E2蛋白中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定

本研究利用能表达猪瘟病毒主要抗原E2蛋白的复制型水泡口炎假病毒免疫Balb/c小鼠、采用常规方法进行细胞融合、在杂交瘤细胞的筛选中引入能表达荧光素酶的猪瘟病毒E2蛋白假型的非复制型的HIV病毒检测系统制备具有中和作用的抗猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白的单克隆抗体并分析其生物学活性,为猪瘟病毒中和性单抗的制备引入新的可行的方法并为猪瘟疫苗的相关研究提供新的工具。本研究包括主要以下三部分:1拯救囊膜表面表达猪瘟病毒E2蛋白的复制型水泡口炎假病毒利用水泡口炎病毒反向遗传体系,共转染分别表达水泡口炎病毒核衣壳蛋白、磷蛋白和聚合酶蛋白的质粒以及携带有猪瘟病毒E2基因的复制型水泡口炎病毒载体于BHK-21细胞中并利用Western Blot、间接ELISA以及体外微量中和试验检测和鉴定拯救的假病毒。结果证明成功地拯救出能稳定表达E2蛋白的复制型水泡口炎假病毒,免疫Balb/c小鼠后得到了高效价的抗猪瘟病毒E2蛋白的阳性血清。2制备分泌型E2蛋白应用...  (本文共76页) 本文目录 | 阅读全文>>

浙江大学
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猪瘟病毒C株重组标记疫苗候选株免疫原性与鉴别检测

猪瘟(Classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一类能在家猪和野猪中流行,具有高度传染性的传染病,严重威胁养猪业发展。CSFV是一种含有囊膜的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科瘟病毒属成员,基因组长约12.3kb。病毒蛋白中,结构蛋白E2、Erns以及非结构蛋白NS3为主要免疫原性蛋白,其中E2诱导中和抗体,与病毒入侵和致病性紧密相关。我国对于猪瘟防控的主要策略为猪瘟兔化弱毒苗群体免疫,但无法通过血清学方法区分疫苗免疫和自然感染动物。研究表明,CSFV流行毒株也已经从之前的group 1转向group2,新基因亚型毒株不断出现。CSF呈现地方性流行,症状非典型化,甚至在免疫猪群中也有发病。因此,开发新型猪瘟分子标记弱毒疫苗仍然是当今研究热点。本课题主要研究目标:(1)利用特异性单克隆抗体探明猪瘟病毒1型和2型E2抗原区的差异;(2)构建基于疫苗C株、携带流行毒株E2基因的嵌合重组病毒,评估...  (本文共116页) 本文目录 | 阅读全文>>

西北农林科技大学
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SUVEC多次传代的CSFV E2基因遗传变异及转染Y8基因细胞株的建立

研究发现猪瘟病毒不是对猪的所有体细胞都有致细胞病变作用(CPE),而只是对与CSFV具有高度亲和力的细胞有CPE的作用。位于病毒粒子表面的E2蛋白在病毒感染进入细胞的过程中,可与宿主细胞表面的E2特异性受体相互作用,从而介导病毒进入细胞中,用一定浓度的E2蛋白可完全阻断CSFV对体外培养细胞的感染过程。因此,E2蛋白对病毒感染细胞进而增殖引起细胞病变具有重要作用。研究表明猪瘟病毒引起猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)发生CPE的原因可能是猪血管内皮细胞被猪瘟病毒感染后刺激某种/某些敏感基因,表达了某种/某些蛋白酶,将猪瘟病毒的p125蛋白裂解成为p80蛋白所致。本研究将猪瘟病毒在血管内皮细胞上多次传代后,采用分子生物学方法和软件分析猪瘟病毒E2基因的遗传变异情况,同时在前期工作的基础上,从4个敏感基因中选出了Y8基因,将其转入PK-15细胞中,为其基因功能及猪瘟病毒致病机理的研究奠定了基础。1.无菌采取猪脐带,分离脐静脉,用胶原...  (本文共67页) 本文目录 | 阅读全文>>

西北农林科技大学
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猪瘟病毒E2基因的表达及其间接ELISA诊断方法的研究

本研究试图从分子生物学角度来揭示目前猪瘟仍频繁发生的原因,为广泛开展CSFV分子流行病学的研究提供基础资料,为CSF的防制提供科学依据和理论支持,为猪瘟诊断提供稳定的标准诊断抗原及诊断方法。本论文由4部分构成:1.应用RT-PCR和nPCR扩增了7株国内近期流行的CSF野毒E2基因,分别克隆于pGEM-T Easy载体,对其进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列推导,同时将其与C株,Alfort株,Brescia株进行了同源性比较及遗传进化分析,并构建了CSFV的遗传发生树。结果表明,7株流行野毒与C株,Alfort株,Brescia株核苷酸序列同源性分别为91.6%~94.5%,89.2%~92.7%和85.9%~89.3%,氨基酸同源性分别为91.2%~95.8%,88.9%~92.0%和84.0%~90.1%;而7株野毒之间的差异很小,其核苷酸序列同源性为95.8%~99.7%,氨基酸同源性为96.3%~99.1%。所绘制的遗传...  (本文共78页) 本文目录 | 阅读全文>>

扬州大学
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猪源BVDV-2感染性克隆的构建及非结构蛋白N~(pro)的相关功能探析

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)的宿主谱非常广,除了感染牛以外,还可引起猪、羊、鹿、骆驼和多种野生动物发病。该病的临床症状具有多种形式,包括牛病毒性腹泻-黏膜病、繁殖障碍、血小板减少与出血综合征、持续性感染、免疫耐受等。母畜在怀孕后30-120天内感染非致细胞病变型(noncytopathic,NCP) BVDV,由于此时胎儿的免疫系统尚未发育完全,不能免疫识别外源的NCP型BVDV,因此可造成胎儿死亡、产死胎和畸形胎等,存活的胎儿虽表现正常,但持续性感染BVDV并终身带毒,成为重要传染源。事实上,持续性感染是BVDV在环境中维持长期存在的重要原因之一。近年来,由于猪和感染BVDV的牛群直接或间接接触、给猪饲喂牛奶或牛下水、或接种污染BVDV的猪瘟疫苗等要素,使得猪群中BVDV感染率急剧升高。值得注意的是,猪瘟疫苗制备过程中使用的牛血清和细胞系也一定程度上增加了猪感染BVDV...  (本文共110页) 本文目录 | 阅读全文>>