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大肠杆菌细胞表面展示体系的建立及其应用

本研究通过对大肠杆菌外膜蛋白C(OmpC)的结构分析与研究,构建了一个新的细菌细胞表面展示体系。这一体系以大肠杆菌Ompc为运载蛋白,以“三夹板”融合的形式将外源蛋白嵌入Ompc的表面暴露位点,从而实现了外源蛋白在大肠杆菌细胞表面的定位。这是国内外首例利用大肠杆菌Ompc蛋白构建展示体系的报道。本研究分别选用多聚组氨酸肽和木聚糖酶作为乘客蛋白对该体系在全细胞吸附和全细胞催化等方面的应用进行了探索性研究,并初步证实了多聚组氨酸肽展示菌在重金属离子吸附领域的应用价值。本研究分析了Ompc的一级结构,模拟出它在菌体外膜上的穿梭折叠方式,进而选择有PstⅠ和EcoRⅤ单一识别位点的第七外环(L7)作为外源蛋白的嵌入位点。首先,设计一对引物从大肠杆菌MC4100菌株的染色体上克隆到ompC基因及其启动子。同时,由交叠PCR人工合成出编码六聚组氨酸肽(6His)的DNA序列(6His),并通过该序列的多拷贝连接得到6His的二体、三体、六体  (本文共84页) 本文目录 | 阅读全文>>

华中农业大学
华中农业大学

基于黄单胞菌冰核蛋白N端表面展示体系的建立及初步应用研究

本文以野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris ACCC 10049)为出发菌株,克隆了具有表面展示活性的冰核蛋白基因(INP,ice nucleaiton protein)的N端(大小为541bp),并与NCBI中登录的冰核基因进行了同源比对分析,其与黄单胞菌ATCC 39913菌株的冰核基因同源性高达99%。对该冰核蛋白N端(inaXN)进行了蛋白理化性质分析,二级结构和跨膜区结构预测,初步确定该冰核蛋白N端具有锚定蛋白功能。为了确定所克隆获得的冰核蛋白N端是否可以作为锚定蛋白用于表面展示,本研究选择了活性易于检测且具有一定应用前景的短小芽孢杆菌脂肪酶(Bacilluspumilus YZ02 lipase,bpL)作为乘客蛋白,与载体蛋白INP的N端相融合,构建融合基因inaXN-bpL,并克隆于超表达载体pET28a(+),得到重组质粒pETinaXN-bpL,然后转化到宿...  (本文共74页) 本文目录 | 阅读全文>>

华中农业大学
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利用冰晶核蛋白构建细菌细胞表面展示体系及其应用研究

冰晶核蛋白(Ice nucleation protein,简称为INP)是一种分泌型表面蛋白质,存在于丁香假单胞菌、欧文氏菌等十余种革兰氏阴性菌中。近十年来,冰晶核蛋白作为细菌细胞表面展示系统的运载蛋白受到了广泛重视,被用来展示不同种类的外源蛋白,逐渐被探索应用于各种生物技术领域。本研究通过克隆实验室自行分离的一株丁香假单胞菌高冰核活性菌株MB03的冰核基因(inaQ),对其表达特性、表达产物的跨膜分泌活性、作为运载蛋白的表面展示性能及重组菌株在无机磷吸附和抑制软腐病原菌侵染的应用性能进行了研究,结果如下:1.冰核基因的克隆用EcoR I/Pst I酶切MB03菌株总DNA,回收4-5 kb的酶切片段构建基因文库。根据已发表inp基因的保守序列设计简并性杂交探针,通过原位杂交法从大肠杆菌文库中筛选并克隆到包含启动子序列和完整编码框的冰核基因,命名为inaQ (GenBank:EU360731)。序列比对分析表明,inaQ基因与另...  (本文共138页) 本文目录 | 阅读全文>>

《食品与发酵工业》2017年06期
食品与发酵工业

酿酒酵母孢子表面展示系统的构建及应用

表面展示系统是运用微生物自身功能把外源蛋白或多肽展示在细胞表面,从最早的噬菌体表面展示到细菌、杆状病毒,再到目前应用广泛且安全性高的酵母表面展示,表面展示系统取得了较大进展[1-2]。而关于利用酿酒酵母孢子来进行表面展示的方法还未见报道。酿酒酵母在以醋酸盐为唯一或主要碳源,并辅以缺乏氮源等特定条件下,就会以孢子生殖的方式进行繁殖,在胞内形成孢子[3]。孢子壁具有4层结构,由里到外依次为甘露糖蛋白层、葡聚糖层、壳聚糖层以及二酪氨酸层[4-5]。较酿酒酵母营养细胞壁来说,孢子壁外层多壳聚糖层和二酪氨酸层,由于壳聚糖层的蛋白交联作用及致密网状结构二酪氨酸层的拦截作用,在酵母孢子中表达分泌蛋白或带有分泌型信号肽的非分泌蛋白时,蛋白会被固定到孢子表面[6](如图1)。孢子壁的合成是有顺序的,比如最外层二酪氨酸层只有在次外层壳聚糖层形成后才开始合成[7-8]。利用孢子壁合成的这一特点,实验室前期构建了一系列研究孢子壁的缺陷型菌株,本实验中利...  (本文共7页) 阅读全文>>

《生物工程学报》2010年10期
生物工程学报

芽胞表面展示技术研究进展

表面展示(Surface display)是一种有价值的基因操作技术,它使表达的外源肽(或蛋白质的结构域)以融合蛋白形式展现在噬菌体或细胞的表面,被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性,因而可以用于多肽性质、相互识别和作用的研究,以及构建大型的展示库。第一个表面展示系统由Geroge P.Smith等于1985年建立,他利用丝状噬菌体M13的pIII蛋白将抗体固定在噬菌体表面,为抗原的生产提供了一种新的技术和方法[1]。该实验的成功使表面展示系统引起了研究学者们越来越广泛的关注,并建立了多样的表面展示系统,如噬菌体表面展示系统[2]、酵母表面展示系统[3]、细菌表面展示系统[4]和新发展起来的芽胞表面展示系统[1]。与噬菌体和细胞等表面展示系统相比,虽然芽胞表面展示系统起步较晚,但具有表达过程更为简捷有效的优点。由于芽胞具有特殊的生理结构,使得融合蛋白在固定到表面的过程中无需经过穿膜过程,大大增加了融合蛋白正确...  (本文共6页) 阅读全文>>

《上海畜牧兽医通讯》2008年03期
上海畜牧兽医通讯

微生物表面展示技术的发展及应用

微生物表面展示技术是利用基因工程手段实现外源肽段(或蛋白质结构域)以融合蛋白形式在微生物表面进行展示的新型基因工程技术,被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性。其重要特征和优点是靶蛋白与其编码DNA处于同一个病毒或细胞中,可以通过序列测定确定DNA序列并进一步推导外源蛋白氨基酸组成,从而实现了基因型和表现型的统一。自1985年Smith等人创建噬菌体表面展示技术以来,微生物表面展示技术在许多研究领域一直被寄予厚望,经过20多年的研究和发展,已经得到广泛应用。本文就微生物表面展示技术的发展及其应用状况做一简要介绍。1微生物表面展示技术基本原理微生物表面展示技术是利用基因重组方法把靶蛋白(外源肽段或蛋白质结构域)基因序列与特定的载体蛋白基因序列(又叫定位序列)融合后导入微生物宿主细胞,从而使靶蛋白表达并定位于微生物细胞表面。靶蛋白序列与载体蛋白序列的融合方式主要有N端融合、C端融合和插入融合。最近有人报道通过基因置...  (本文共2页) 阅读全文>>

《应用与环境生物学报》2005年02期
应用与环境生物学报

表面展示技术在污染环境生物修复中的应用

自从上世纪 70年代后期重组DNA技术出现以来,已有许许多多的蛋白质成功地在细菌、真菌、哺乳动物细胞和植物中表达.近年来,基因表达技术的一个最令人兴奋的发展是将表达蛋白直接定位于不同生物的细胞表面,这一突破性的技术使得细菌疫苗、多肽库和酶库的高通量筛选、全细胞吸附剂、重组生物催化剂及基于细胞的临床诊断成为可能.环境污染物的生物降解过程是以酶促反应或生物吸附为基础的,用于污染环境生物修复的生物体要完成对有害有毒物的降解、消除,就必须使细胞内酶、蛋白质或污染物跨越细胞膜的屏障,这一过程往往比较缓慢,速度也很有限.表面展示技术很好地解决了这一问题,它将参与生物降解的蛋白质、酶直接展示在细胞表面,使生物修复过程快捷高效.1 表面展示技术表面展示技术是利用基因工程手段将外源基因或一组一定长度的随机寡核苷酸片段克隆到特定的表达载体中,使其表达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面.表面技术是诸多基础研究与实...  (本文共4页) 阅读全文>>