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苏云金芽胞杆菌帮助蛋白对杀虫晶体蛋白表达的影响

本文主要研究了苏云金芽胞杆菌以色列亚种的20kDa帮助蛋白对库斯塔克亚种的杀虫晶体蛋白基因crylAc的表达及其伴胞晶体形成的影响,针对棉铃虫等重要农业害虫构建并向野生型菌株中转化了含20kDa帮助蛋白基因的位点专一性重组质粒,获得了三株杀虫晶体蛋白高效表达的苏云金芽胞杆菌工程菌。主要结果如下:在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株中,20kDa帮助蛋白对crylAc的表达和伴胞晶体形成有明显的促进作用,毒力也有显著提高。结果表明,在该帮助蛋白的参与下CrylAc的表达量为不含帮助蛋白对照菌的3.5倍,形成的双金字塔形伴胞晶体长达1.85μm、宽0.85μm,体积为对照菌的3倍,同时对初孵棉铃虫幼虫的毒力提高了1.5倍。进一步分析表明,20kDa帮助蛋白是通过防止CrylAc新生肽免受胞内蛋白酶的降解而使得CrylAc表达量提高的。本试验还利用苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的位点专一性重组系统,构建了含有crylAc10和20kDa蛋白  (本文共85页) 本文目录 | 阅读全文>>

华中农业大学
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苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的C-半段对Vip3Aa7和Cry7Ba1蛋白包含体形成的影响

本论文利用苏云金芽胞杆菌的表达调控元件及来自Cry1C、Cry1Ac和Cry7Ba1蛋白和晶体形成,蛋白稳定相关的C-半段,辅助蛋白p20等研究对营养期杀虫蛋白Vip3Aa7,杀虫晶体蛋白Cry2Aa,Cry3Aa晶体形成,表达量和杀虫活性的影响,建立了一个苏云金芽胞杆菌高效表达体系;并通过Cry1C、Cry1Ac和Cry7Ba1蛋白的N-、C-半段互换,研究了苏云金芽胞杆菌Cry1类杀虫晶体蛋白的C-半段对Cry7Ba1晶体蛋白溶解性,晶体形成及毒性的影响,主要结果如下:1.苏云金芽胞杆菌C-半段使Vip3Aa7形成包含体并且显著提高其表达量本文利用苏云金芽胞杆菌ICPs蛋白的各种表达调控元件,希望提高营养期杀虫蛋白Vip3Aa7的表达量,改善其因为分泌到胞外给生产应用带来的不便,研究芽胞依赖型BtⅠ-BtⅡ启动子,上游调控区,终止子及大分子杀虫晶体蛋白C-半段对Vip3Aa7表达量和包含体形成的影响,结果表明:1.1 Cry...  (本文共132页) 本文目录 | 阅读全文>>

华中农业大学
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比较蛋白质组学揭示苏云金芽胞杆菌YBT-1520不同生长期代谢变化与杀虫晶体蛋白合成的翻译调控间关系

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一种产生杀虫晶体蛋白的革兰氏阳性芽胞杆菌。它产生的杀虫晶体蛋白在国内外的各种害虫防治上得到了广泛应用。在研体内杀虫晶体蛋白能够积累到细胞干重的20-30%。这种芽胞杆菌体内大量表达蛋白并形成晶体的机制受到研究者的广泛关注。虽然杀虫晶体蛋白在转录调控上的机制研究的比较透彻,但是在翻译以及翻译后修饰的研究上还很欠缺。为了更加清楚地了解这个机制,我们使用了蛋白质组学方法来研究Bt杀虫晶体蛋白在翻译水平的调控与细胞代谢之间的关系。本研究通过2-DE和MALDI-TOF-MS方法建立了苏云金芽胞杆菌YBT-1520在合成培养基不同生长时期的比较蛋白质组研究。首先我们对不同pH值范围(pH4-7、pH5-8、pH3-10、pH7-11)的苏云金芽胞杆菌全细胞蛋白的双向电泳条件进行了摸索,发现pH4-7为最适蛋白分离pH范围。使用pH4-7的双向电泳分离条件,我们完成了苏...  (本文共119页) 本文目录 | 阅读全文>>

东北农业大学
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苏云金芽胞杆菌新基因的克隆及杀虫蛋白生物活性的研究

每年,农业虫害在全球范围内对农作物造成的损害,是农作物减产的最主要因素之一。由于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringensis)对大多数农业害虫都具有特异的杀虫活性,并且,对人畜安全,不污染环境。目前,已成为世界上产量最多、应用最广泛的微生物杀虫剂。特别是,随着植物基因工程的发展,利用转基因植物来防治害虫已经进入到实际运用阶段,其中,在抗虫转基因植物方面,Bt杀虫基因得到了最为普遍的应用。本研究在克隆新的cry基因的基础上,用Cry2Ab、Cry2Aa、Cry1Ca、Vip3Da或Vip3Af杀虫蛋白对水稻二化螟、大螟的杀虫活性进行了生物活性分析;改良了培养Bt菌株的传统牛肉膏蛋白胨培养基。1.本文从实验室自行分离的C006菌株中,经PCR扩增鉴定、酶切分析和构建质粒DNA文库的方法,获得了含有10kb阳性片段转化子,对其进行亚克隆,经测序分析发现该片段含有2种cry基因,其中一个是新的cry1类基因,与己知的cry...  (本文共64页) 本文目录 | 阅读全文>>

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苏云金芽胞杆菌Cry7Ba1晶体蛋白溶解性改良

苏云金芽胞杆菌华中亚种YBT978产生大分子量晶体蛋白Cry7Ba1,与其它典型晶体蛋白不同的是Cry7Bal需要在强碱性缓冲液中(pH11.5)才能溶解,常规杀虫晶体蛋白在弱碱性缓冲液中就能溶解,并且之前相关研究表明只有溶解后的Cry7Bal才能表现出对小菜蛾的毒力(LC_(50):1.33μg/mL)。Cry1Ac和Cry1C是Cry1类晶体蛋白,能形成典型的菱形晶体,并且其晶体蛋白在弱碱性条件下(pH9.5)能有效溶解,从而发挥其杀虫活性。本试验为了找出晶体溶解性与蛋白结构的关系,分别用Cry1Ac和Cry1C晶体蛋白的N端和C端替换Cry7Ba1的N端和C端,结果发现替换后的4个重组蛋白都不能形成完好的晶体,只能形成包涵体。当Cry7Ba1的C端被Cry1Ac和Cry1C的C端替换后,重组蛋白0184,0185能像Cry1Ac和Cry1C等其它晶体蛋白一样在弱碱性条件下(pH9.5)有效溶解,而且其毒力没有发生明显变化(...  (本文共56页) 本文目录 | 阅读全文>>

华中农业大学
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利用Tn5401转座子构建解离载体并在苏云金芽胞杆菌中高效、稳定表达AiiA蛋白

苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白是一种胞内蛋白,能降解参与诱导调控多种植物病原菌致病基因表达的N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子(AHLs)。AiiA蛋白在苏云金芽胞杆菌各亚种中广泛存在,但表达量低,对N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子的降解活力不高:同时由于AiiA蛋白是一种非分泌型蛋白,致使它无法与环境中的N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子直接发生作用,限制了其降解活性的发挥。S层(Surface layer)是位于细胞外壳最外层的一类表面结构,生物圈中有S层的生物体普遍存在,尤其在占细菌和真细菌中,S层是最常见的表面结构之一。这层结构对细菌细胞的生存及完整性有着很重要的作用。S层是由蛋白质或糖蛋白亚基组成的单分子晶体点阵,它们形成有孔的网格结构覆盖在细胞表面。利用S—层蛋白可以进行细胞表面展示,将目的蛋白或多肽带到胞外并锚定在细胞表面,而保持原有目的蛋白的生物活性。苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白基因的启动子是一类强启动子,其启动表达的S-...  (本文共57页) 本文目录 | 阅读全文>>