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猪瘟病毒E2基因在大肠杆菌中的高效表达及其表达产物的制备

猪瘟病毒(classical swine fevev virus,CSFV)是严重危害养猪业的最重要的病原之一,E2蛋白是其主要的保护性抗原蛋白,因此是CSFV抗原性、抗原变异和血清学诊断抗原体外表达研究以及猪瘟(classical swine feve,CSF)亚单位标记疫苗研制的主要对象。本研究在大肠杆菌中高效表达了CSFV石门株E2基因。对表达的E2及mE2蛋白包涵体进行了复性和纯化,建立了复性和纯化方法。构建了CSFV石门株E2基因可溶性表达的重组质粒,并得到表达。结果如下:1.利用PCR突变技术对猪瘟病毒石门株的E2基因进行了改造,将改造后的基因克隆到表达载体pET-28a(+)上,构建了重组质粒pETE2(SW),转入至宿主菌BL21(DE_3)中,在IPTG的诱导下,重组菌可高效表达目的基因,表达量达菌体蛋白总量的28%。2.超声破菌分离表达的CSFV E2蛋白和mE2蛋白包涵体,用8mol/l尿素变性溶解,利用T  (本文共72页) 本文目录 | 阅读全文>>

西北农林科技大学
西北农林科技大学

猪瘟病毒E2基因遗传变异及体外表达研究

针对频繁出现的弱毒疫苗免疫失败现象和免疫猪群持续带毒等猪瘟(CSF)防制中的重大问题,本项研究从病毒的分子水平入手,试图从病毒分子变异水平以及当前流行毒的分子差异程度澄清原因,并针对CSF的持续感染研制出高效安全的基因工程标记疫苗和诊断试剂,为彻底消灭CSF提供科学依据和技术支撑。主要研究内容包括:1.猪瘟病毒主要免疫原E2基因的序列分析:利用反转录PCR(RT-PCR)及套式PCR(nPCR)方法扩增了中国猪瘟兔化弱毒株(C株)兔脾组织毒保护性抗原E2(gp55)基因,成功地将其克隆并测定核苷酸序列,与国内外已发表的猪瘟病毒(CSFV)E2基因序列比较的结果是:C-株兔脾毒与C-株细胞(SK6)毒、C-株疫苗(犊牛睾丸细胞,CSFV-C)毒CSFV-SM株(石门)毒、Bresia株(荷兰)毒、Alfort株(德国)毒的E2核苷酸序列同源性分别为98.87%、98.34%、94.58%、91.00%、80.78%;氨基酸同源性分...  (本文共141页) 本文目录 | 阅读全文>>

四川农业大学
四川农业大学

含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用

为适应以减毒胞内寄生菌为运载体的兽用基因疫苗研究发展趋势,研究构建含有减毒胞内寄生菌自身内源性诱导启动子的新型双功能基因疫苗表达载体,以增强基因疫苗诱导有效保护性免疫。基于以上考虑,本课题研究旨在研制含猪霍乱沙门菌内源性诱导启动子的新型双功能基因疫苗通用表达载体,既能够在运载体原核细胞中可调控表达携带抗原基因,又能够在真核细胞中启动表达携带抗原基因,以期与S.C500合用开发适于粘膜免疫的猪群重组活菌疫苗。为此,本研究首先扩增出猪霍乱沙门菌nirB、pagC两基因启动子区域片段,然后分析其启动活性,进一步构建新型双功能表达载体pCB-neo、pCC-neo,系统研究表达载体的启动活性特点,检验S.C500运送以pCB-neo、pCC-neo基础构建的基因疫苗的可行性。本课题研主要研究内容包括:Ⅰ.猪霍乱沙门菌nirB、pagC基因启动子区域分子克隆及其生物信息学分析为获得沙门菌nirB、pagC两基因启动子区域片段,利用PCR技...  (本文共191页) 本文目录 | 阅读全文>>

《河南农业科学》2009年09期
河南农业科学

猪瘟病毒E2基因的克隆表达

猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起猪的一种高度接触性传染病。CSFV可引起感染猪只高热、皮肤潮红及神经系统症状,死亡率很高,给世界养猪业造成了巨大的经济损失[1]。20世纪80年代末和90年代初确定了CSFV的基因组结构并测定了其全部核苷酸序列,随后确定了E0和E2囊膜糖蛋白是CSFV的保护性抗原。其中E2是主要的保护性抗原,能诱导机体产生中和抗体,所以人们一直尝试把E2蛋白作为研制CSFV新型疫苗的首选靶蛋白[2]。本试验以CSFV的主要保护性抗原基因E2为研究对象,在大肠杆菌中高效表达了E2基因,为猪瘟病毒的免疫制品研究提供基础。1材料和方法1.1菌株和质粒突变后的CFSV cDNA由成都军区疾病预防控制中心军事医学研究所李作生博士惠赠。猪瘟高免血清、DH5a、BL21(DE3)、pET-28a由云南农业大学微生物实验室保存。1.2主要试剂BamHⅠ、XhoⅠ、Taq酶、...  (本文共3页) 阅读全文>>

《广东畜牧兽医科技》2016年03期
广东畜牧兽医科技

猪瘟病毒四川分离株E2基因克隆及生物信息学分析

Cloning and Bioinformatics Analysis of E2 Gene of Classical Swine FeverVirus Isolated from Sichuan StrainLI Yan,XIE Jing,WANG Qiushi,LI Jiangling,LIAO Dangjin,CAO Ye,LI Xingyu,LUO Dandan(Sichuan Academy of Animal Science,Chengdu 610066,China)猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种严重的猪传染病,具有高度接触传染性,流行广泛,高死亡率,不同品种、不同年龄的猪都可能发生。这些特点,让CSFV成为我国养猪业最主要的病源之一。猪瘟被世界动物卫生组织(OIE)列入需要申报的动物传染病名录,我国农业部将其列为病毒编号氨基酸长度表1猪瘟病常见亚种E2蛋白氨基酸长度AY575657M31768D4...  (本文共5页) 阅读全文>>

中国农业科学院
中国农业科学院

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的表达及其单克隆抗体的制备

猪瘟病毒(classical swine fever virus;CSFV)E2囊膜糖蛋白是猪瘟病毒的主要结构蛋白之一,是猪瘟病毒中和抗体的主要靶标,是抗猪瘟病毒感染的主要保护性抗原;因此,猪瘟病毒E2蛋白是开发猪瘟新型疫苗、诊断试剂及研究猪瘟病毒致病机理的重要蛋白分子。利用TRIzol试剂提取猪瘟病毒兔化弱毒疫苗(C株)的基因组RNA,经反转录获取其cDNA,再以cDNA为模板,扩增编码E2蛋白主要抗原区的DNA片段(378bp),再将扩增产物正确插入到原核表达载体pPROEX-HTb中,得到重组质粒pPROEX-tE2,然后以其转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,高效表达出了带有组氨酸标签的截短的重组蛋白(tE2),占细菌总蛋白的35%。经Western blotting分析和间接ELISA检测,该重组蛋白能被猪瘟病毒抗血清所识别。用IPTG大量诱导重组质粒pPROEX-tE2转化菌后,通过亲和层析柱纯化重组蛋白tE2,以...  (本文共54页) 本文目录 | 阅读全文>>

《安徽农业科学》2013年28期
安徽农业科学

抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classicalswine fever virus,CSFV)引起的一种急性或慢性、热性和高度接触性传染病。CSFV感染后不仅会造成较高的死亡率,而且具有不断向外排毒的危险性,严重危害全球养猪业,造成巨大的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定必须报告的传染病,并规定为国际重点检疫对象,我国也将猪瘟列为一类动物疫病。CSFV隶属黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus),有囊膜,基因组为单股线状正链RNA,长约12.3 kb,含有单一的开放阅读框(ORF),编码含3 898个氨基酸残基的多聚蛋白,该蛋白经病毒和宿主细胞酶的作用,裂解为4种结构蛋白(衣壳蛋白C和囊膜糖蛋白Erns、E1、E2)和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。其中,Erns、E2和NS3可以诱导机体...  (本文共3页) 阅读全文>>