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RNA干扰治疗马凡综合征的载体和靶位点基础研究

目的:以中国人马凡综合征C1037del型突变为基础,设计并构建针对此突变FBN1基因mRNA的特异性RNA干扰质粒载体,研究此载体通过在人体细胞中有效介导RNA干扰,发挥对目的基因高效且特异的抑制作用。同时,初步探讨C1037del位点作为RNA干扰治疗马凡综合征有效靶位点的可行性。方法:采用携带H1启动子的pBSHH1质粒,设计并构建可有效表达发夹状RNA的特异性RNA干扰载体(pGi,pEi,pMi)。同时,为了利用绿色荧光蛋白的报告基因作用,构建包含C1037del位点序列和包含正常FBN1基因相应序列的融合蛋白表达质粒。在阳离子脂质体介导下,通过共转染人HT1080细胞株,流式细胞仪分析、检测荧光表达的变化,来研究RNA干扰pBSHH1载体的有效性,C1037del位点的位置效应。结果:限制性内切酶酶切图谱和DNA测序结果显示,构建的RNA干扰pBSHH1载体和EGFP融合蛋白表达质粒均符合实验设计要求。细胞水平共转染  (本文共82页) 本文目录 | 阅读全文>>

浙江大学
浙江大学

shRNA表达框的快速制备及其在抗HBV相关研究中的应用

慢性HBV感染的抗病毒治疗一直是医学界的重大难题,现有干扰素和拉米夫定的临床疗效有限,不断尝试进行的其它治疗方法,至今又尚无令人满意的结果,RNA干扰技术的出现,为处于困境中的研究又带来一线新的希望。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)以序列特异性的方式引发的转录后同源性RNA降解的现象,也称为转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS),是生物体针对外来转座子和病毒感染进化形成的一种古老而保守的防御机制。在哺乳动物系统中,短至21-~23-nt的双链RNA可以作为小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)分子在宿主细胞内快速、高效、特异地引发外源或内源性靶mRNA的降解,进而抑制相应基因的表达,却不引起非特异性干扰素应答。这一重大发现使得RNA干扰技术迅速发展...  (本文共106页) 本文目录 | 阅读全文>>

浙江大学
浙江大学

RNA干扰抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

慢性乙型肝炎是我国的高发疾病之一,是导致肝纤维化和肝癌的主要原因。目前治疗慢性乙型肝炎的药物主要是以拉米呋啶和阿的福韦等核苷类似物为主的抗病毒药物和以α干扰素为主的免疫调节剂,但是临床治疗效果不甚满意。RNA干扰是近年来生命科学的一个重大发现,其原理是同源双链RNA导入宿主细胞,通过对目标基因mRNA的特异性切割或降解作用,导致目标基因的不表达或减效表达。该现象是转录后基因沉默的一个重要机制,也是一种古老的抵御外来病原侵入的防御机制,在植物,线虫,果蝇和哺乳动物中广泛存在。在成熟的哺乳动物细胞中,超过30核苷酸的长双链RNA激活蛋白激酶R(PKR)和2-5’寡腺苷酸(OAS)途径,引起干扰素样的非特异性抑制,而不能引起高效特异的基因沉默,并不能特异有效的抑制同源基因的表达,这使得RNA干扰在一段时间内没有更好的推广。2001年Tuschl研究小组证实21个核苷酸长度的小双链干扰RNA(small interfering RNA....  (本文共79页) 本文目录 | 阅读全文>>

浙江大学
浙江大学

自发性高血压大鼠钙离子通道相关基因表达谱的RNA阵列研究

原发性高血压的病因和发病机制迄今尚未完全阐明,从20世纪40年代Page提出镶嵌学说,认为高血压是遗传、环境、神经、内分泌、血流动力学等多方面因素作用的结果。国内外研究资料表明,原发性高血压属于多基因遗传的复杂性状疾病。目前,已经确认一些高血压相关基因,一批与高血压可能有关的候补基因正在研究之中。钙离子(Ca~(2+))在原发性高血压发病机制中起重要作用。Ca~(2+)的活动与心肌和血管平滑肌的电活动以及收缩功能密切相关。高血压的发病与细胞Ca~(2+)转运缺陷密切相关。已知细胞内Ca~(2+)主要贮存于肌浆网。肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)通过调节细胞内游离钙浓度来控制细胞收缩和舒张。当肌浆网上钙释放通道(calcium release channel)被激活开放时,Ca~(2+)便从SR进入胞浆,当胞浆内游离钙达10~(-5)M时肌钙蛋白被激活。肌钙蛋白Ⅰ构象改变使肌球蛋白和肌动蛋白相互接触,产...  (本文共102页) 本文目录 | 阅读全文>>

第一军医大学
第一军医大学

药物诱导K562及HEL细胞珠蛋白基因表达前后细胞微小RNA的分离鉴定

地中海贫血在世界范围内分布广,发病率高,危害大,长期以来其相关研究一直是生物医学研究的热点。重型β地中海贫血可以被异常高表达的γ基因改善临床症状的现象,促使科学家围绕着如何阻止γ—珠蛋白基因向β—珠蛋白基因切换及如何重新激活已趋于关闭的γ—珠蛋白基因等问题开展了各种各样的研究工作。已经发现一些正向作用元件与反向作用因子,如:SSE(stage selector element)、LCR(Local controlregion)及GATA-1、AP1、SP1、EKLF(Erythroid Kruppel-like factor)与NF-E2等与γ及β—珠蛋白基因的表达切换有关。某些药物如羟基脲、丁酸盐等可以诱导γ—珠蛋白基因重新表达,但在临床应用过程中却呈现出个体差异。研究发现,羟基脲可使cGMP增加,后者可能影响某些转录因子而干预γ—珠蛋白基因表达。丁酸盐可抑制组蛋白去乙酰化酶的活性,还可以通过抑制ERK、激活p38信号转导通路...  (本文共83页) 本文目录 | 阅读全文>>

第二军医大学
第二军医大学

SARS-CoV结构蛋白的抗原性鉴定、DNA免疫与RNA干扰的研究

2002年末始发于中国广东省的非典型肺炎(infectious atypical pneumonia,),随后也被称为严重急性呼吸综合征(The severe acute respiratory syndrome,SARS),具有高度传染性与致病性。疫情于2003年2月传播至香港,随后迅速向全球各地蔓延。其致病因子于2003年3月被鉴定为一种新的冠状病毒,被命名为SARS冠状病毒(SARS-CoV)。冠状病毒是一类球形、有包膜的病毒,基因组为长约30 kb的单股正链RNA,主要引起人和动物的呼吸道与肠道疾病。SARS-CoV的基因组结构为:5′-帽状结构-复制酶(rep)-刺突糖蛋白(S)-小包膜蛋白(E)-膜糖蛋白(M)-核衣壳蛋白(N)-polyA尾-3′。本研究用大肠杆菌表达出了SARS-CoV的结构蛋白及3CL~(pro)蛋白,检测了SARS恢复期患者血清中的抗体情况,构建了S与N蛋白的DNA疫苗,进行了小鼠免疫试验,并...  (本文共84页) 本文目录 | 阅读全文>>