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转基因植物外源基因的检测方法及整合位点的研究

由于目前科学技术水平还不能精确地预测转基因可能产生的对人类及环境的安全问题,因而,开展转基因检测、鉴定,成为各国限制转基因作物大量涌入的主要措施。转基因检测的主要目的是鉴定是否为转基因、转的何种成分、含量多少以及是否为批准进口的品种等。有关转基因检测的方法,国内外已有不少报道,但具有单一性,没有通用的筛选、鉴定方法,有关整合位点的研究国外刚刚开始,国内未见报道。本研究根据收集的国内外已商品化的转基因作物品种,选择了能基本覆盖商品化转基因品种的7个外源基因,即:CaMV35S、FMV启动子、NOS终止子、NPTⅡ标记基因和目的基因PAT、EPSPS、CryIA(b)作为筛选目标,以植物18SrRNA基因作为内源参照基因,设计了多对特异性引物,并筛选出最佳组合,优化了检测条件和参数,建立了PCR定性检测方法体系。在此基础上,根据荧光PCR原理,设计、优化引物和荧光探针,建立了荧光PCR定性检测方法体系,并以玉米内源基因(Zein)、  (本文共118页) 本文目录 | 阅读全文>>

《河南师范大学学报(自然科学版)》2012年06期
河南师范大学学报(自然科学版)

植物外源基因拷贝数及插入位点的检测方法与技术

1983年世界第一例转基因植物(烟草)成功问世,随后转基因作物的研究进入快速发展阶段,当前转基因技术已经在多种作物上成功应用,开发了许多具有优良性状的转基因作物,转基因植物已经在世界范围内大量种植.外源基因能否转化到植物体内并且稳定遗传与表达,是转基因植物成功的关键.现研究多认为,外源基因转入植物中可能表达,也可能不表达,这种失活的现象称为基因沉默(Gene silencing).外源基因表达和遗传的稳定性取决于外源基因整合宿主基因的特性及其插入位点的性质,如外源基因整合到受体基因组的拷贝数,受体品种的基因型,以及控制数量性状的基因家族的位置效应等等.各种转基因作物市场化,转基因植物的安全性备受关注,对外源基因拷贝数与插入位点的检测能在基因组水平对转基因植物安全性进行评价.因此,确定外源基因在基因组的拷贝数及插入位点,对于后续研究其外源基因的表达和功能十分重要.1外源基因拷贝数外源基因在植物染色体中的整合方式是随机的,可以分为3...  (本文共6页) 阅读全文>>

大连理工大学
大连理工大学

无载体骨架无选择标记玉米转化体系的优化

植物转基因技术的研究和新产品的开发已取得了突破性进展,在解决人类面临的环境污染、资源短缺等问题显示出巨大的作用。但是,近年来随着人们对生物安全性的关注,载体骨架序列和选择标记基因作为“垃圾DNA”影响着转基因植物的安全性评价。因此,建立无载体骨架无选择标记的转基因技术已成为植物基因工程领域的研究热点。虽然花粉管通道法可以将线性DNA片段导入植物基因组,直接获得无载体骨架无选择标记的转基因植株,但其转化率和可重复性有待提高。玉米是重要的粮食兼饲料作物,在我国农业生产中占有非常重要的地位。本研究以玉米为试材,在花粉管通道法基础上建立并优化了子房滴注转化方法,其操作要点是将DNA转化溶液直接滴加在完全去除花柱的子房上。首先通过苯胺兰染色观察花粉管确定转化操作开始时间为授粉后16 h,然后利用子房滴注法转化无载体骨架无选择标记的线性GFP基因转化元件(GFP基因表达框两侧分别包含25bp T-DNA左右边界序列)。对FITC标记的线性转...  (本文共120页) 本文目录 | 阅读全文>>

南京农业大学
南京农业大学

棉花聚合不同转Bt基因材料的表达特征及转基因正常、突变株间的分子差异研究

植物基因工程研究为培育作物优良新品种开辟了一条崭新的途径,在转基因植物中外源基因能否稳定表达是影响转基因植物应用前景的重要因素。许多情况下,外源基因整合进受体植物的基因组后,其表达和稳定性与外源基因的整合情况如拷贝数和整合位点等方面有关,而拷贝数对外源基因表达的影响,不同的文献报道结果不完全一致。它与外源基因的表达可以是正相关、也可以是负相关,或者拷贝数的多少对外源基因的表达并无明显影响。本研究利用我国培育的聚合不同的拷贝数Bt基因的抗虫棉材料组合,应用生物测定结合半定量RT-PCR的方法,试图分析不同时期、不同聚合剂量的转Bt基因抗虫棉在转录水平上的表达情况。对聚合有4个Bt基因的不同自交世代抗虫材料苗期进行生物测定,可以看出这两套材料虽然都明显具有抗虫性,但却都不如其任何含有两个纯合Bt基因的亲本高,说明Bt基因的表达受到了抑制。在5个自交世代中,(中心94+山西94-24)组合随世代数的增加,幼虫的死亡率下降。由(中心94...  (本文共79页) 本文目录 | 阅读全文>>

西北农林科技大学
西北农林科技大学

利用山羊乳腺生物反应器制备具有免疫原性病毒结构蛋白的研究

畜禽传染病是对养殖业危害严重的一类疾病,不仅对社会造成巨大的经济损失,也给人类健康带来巨大威胁。疫苗接种是防控此类疫病的有效措施,传统的灭活疫苗和弱毒疫苗在防治和消除传染病的流行中发挥了重要作用,但都存在一定安全隐患。亚单位疫苗是致病菌或病毒的具有免疫原性的表面结构蛋白,能诱发机体产生特异性免疫,且具有更高的安全性。哺乳动物乳腺为高效的蛋白合成和分泌器官,是制备具有复杂结构蛋白理想的生物反应器。本研究利用TALE切口酶介导的基因打靶将口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)具有免疫原性的结构蛋白基因定点整合至山羊β-乳球蛋白(BLG)基因座,并通过体细胞克隆生产转基因动物;转基因动物乳中分离纯化得到的的重组蛋白(A-FMDV VP1和CSFV E2)用于小鼠免疫试验,结果表明乳腺表达的重组蛋白具有较好的免疫原性,能够诱发机体特异性体液免疫反应。本研究旨在建立一种利用动物乳腺生物反应器生产...  (本文共127页) 本文目录 | 阅读全文>>

东北林业大学
东北林业大学

转基因白桦外源基因的整合特性与表达稳定性的研究

本文以温室四年生转抗虫基因白桦(Betula platyphylla)为研究材料,提取叶片的基因组DNA和RNA,运用多重PCR,反向引物PCR,反向PCR和RT-PCR等方法,并结合转基因白桦的喂虫实验,分别对转基因白桦外源基因的整合特性和表达特性进行分析,所得结果如下:1.确立多重PCR方法快速检测转抗虫基因白桦外源基因的整合状态的条件,为更深一步研究转基因白桦外源基因整合特性的研究奠定基础,同时证明多重PCR方法运用到转基因白桦外源基因整合检测研究具有方便和快速的特点。2.确定用反向引物PCR(RP-PCR)和正向引物PCR结合的方法研究转抗虫基因白桦外源基因T-DNA整合的拷贝数的条件,并结合Southern杂交确定外源基因T-DNA整合到宿主基因组上的拷贝数,对转基因白桦整合的拷贝数进行分类。3.利用改良的反向PCR(inverse PCR)方法,克隆了12个转基因白桦T-DNA旁侧序列,并对旁侧序列测序分析,初步揭示...  (本文共65页) 本文目录 | 阅读全文>>