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三维诱导分化自体骨髓间充质干细胞修复关节软骨缺损的相关实验研究

目的 利用自体细胞进行软骨修复,是当今软骨组织工程领域最具潜力的发展方向——而改用非软骨来源间充质细胞宋克服传统自体软骨细胞的诸多限制,更是最被看好的新领域。如何充分发挥这些细胞的修复潜力,已成为国内外激烈竞争的前沿课题。本研究紧扣学科发展前沿,以自体骨髓间充质干细胞bMSC体内及体外实验、三维立体墙养和诱导、动态应力刺激、注射型组织工程材料为创新点,适应软骨组织工程应用于临床的实际需要,尝试修复关节软骨损伤,为临床利用软骨组织工程方法修复关节损伤提供实验参考。方法 分为逐渐深入的三大部分,主要包括:1.自体bMSC二维培养和分化:1.1 成年动物自体bMSC分离、培养技巧比较:实验以3个月龄新西兰大白兔为实验对象,在股骨粗隆部、胫骨结节、坐骨结节等骨性标志部位,对克隆形成率、首次传代时间、扩增成功率等指标进行定量测定,筛选溶血纯化法、密度梯度离心法、全血接种法等常用原代培养方法的培养效率,比较并积累穿刺吸取骨髓技巧;1.2 微  (本文共165页) 本文目录 | 阅读全文>>

昆明医学院
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软骨细胞、骨髓基质干细胞复合“双相”骨基质明胶修复兔关节软骨缺损的对比性研究

目的对比性观察兔自体/同种异体骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC_s)经培养诱导成的软骨前体细胞以及软骨细胞(Chondrocyte)复合自体“双相”骨基质明胶(Bone Matrix Gelatin,BMG)构建组织工程软骨,修复兔实验性膝关节软骨缺损的效果,以探讨不同组织工程软骨修复实验性关节软骨缺损的效能及可行性,为进一步临床应用提供实验依据。材料和方法1.抽取兔胫骨骨髓,采用贴壁贴壁筛选法并行改良,获得贴壁生长的MSC_s,体外传代扩增获得足够数量,行CD34、CD44免疫组化鉴定、形态学观察,绘制生长曲线;第3代细胞密集时加入转化生长因子-β_1(Transforminggrowth factor-betal,TGF-β_1)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(Insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)、维生素C(Vitamin C),诱导MSC_s向软骨细胞方向分化...  (本文共139页) 本文目录 | 阅读全文>>

第四军医大学
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组织工程化软骨修复兔关节软骨缺损及其相关研究

关节软骨损伤的修复是骨科面临的难题之一,目前尚未得到很好地解决。传统的治疗如软骨下骨钻孔、磨削、微骨折等存在一定的不足,自体骨软骨、骨膜或软骨膜移植可造成附加损伤,且其来源有限,异体组织的排异反应问题尚未得到很好解决;近年来组织工程的发展有望成为治疗软骨损伤的新方法。本文从五个方面探讨了用组织工程方法修复兔关节软骨损伤及其相关问题。1 诱导骨髓基质细胞(MSC)向软骨细胞分化的实验研究目的:探索用rhBMP-2和高分子透明质酸在体外诱导MSC向软骨细胞分化的可能性。方法:白兔双侧股骨粗隆处抽取4-6ml骨髓后在体外行原代和传代培养,实验分为2组,实验组培养液中含rhBMP-2(100ng/ml),培养瓶底预涂高分子透明质酸;对照组常规培养及传代。传代细胞爬片行H.E染色、甲苯胺兰染色、碱性磷酸酶染色(ALP)、免疫组织化学染色;培养细胞与聚乳酸/聚羟基乙酸(PLGA)复合后植入自体兔股部肌内,大体及组织学观察形成的结节;测定培养...  (本文共108页) 本文目录 | 阅读全文>>

第四军医大学
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腺病毒介导促软骨生长因子基因转染兔自体骨髓基质干细胞修复关节软骨缺损的实验研究

背景 骨关节病是骨科临床上的常见病,关节软骨往往受累。早在200年前人们已经认识到关节软骨损伤后修复能力非常有限,受损的软骨在机械磨损和酶的破坏双重作用下进一步发生退变,常常发展成为退行性关节炎,终致关节疼痛,功能丧失。多年来人们尝试了多种方法修复缺损的关节软骨,如骨膜软骨膜移植、自体骨软骨细胞移植等,都难以获得满意的疗效。现在临床上最常用的方法是人工关节置换,但应用假体存在感染、松动及需要二次翻修等问题。目前国内、外关于关节软骨损伤的治疗趋势已由置换转入修复重建的研究,即运用组织工程学的方法在体外构建组织工程化关节软骨,移植修复关节软骨缺损。随着基因工程的发展,分子生物学与组织工程学有机结合,运用分子生物学的理论和技术,从分子水平研究细胞、组织诱导因子、生物材料及其相互作用,为研制能更有效地恢复、维持或改善病损组织功能的生物替代物奠定基础。特别是以病毒载体为基础的基因转移技术的应用,为组织工程学中细胞因子的获得提供了一条切实可...  (本文共99页) 本文目录 | 阅读全文>>

第二军医大学
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TGF-β_1基因修饰间充质干细胞修复关节软骨缺损的实验研究

目的:研究Ad5/CMV-TGF-β_1基因修饰的骨髓间充质细胞/骨膜骨块复合移植修复关节兔关节软骨全层缺损的效果。方法:1.通过体外细胞培养的方法将MSCs由骨髓血中分离出来并加以纯化,并进一步在体外培养条件下研究其增殖及生长特性;2.构建Ad5/CMV-TGF-β_1真核表达载体系统;3.将Ad5/CMV-TGF-β_1基因对骨髓间充质干细胞进行转染并研究TGF-β_1的体外表达情况;4.用Ad5/CMV-TGF-β_1基因修饰的骨髓间充质干细胞/骨膜骨块复合组织移植修复兔股骨滑车关节软骨全层缺损,分为含基因修饰细胞组(A)和不含基因修饰细胞组(B),分别在术后4、8、12、24周取材。从大体观、组织切片HE染色、特殊染色、免疫组化等方面了解关节软骨缺损的修复情况及TGF-β_1的表达情况。结果:1.在体外培养条件下兔骨髓间充质干细胞的增生分裂十分活跃,可以通过培养使其实现数目的扩增;2.含有TGF-β_1基因cDNA的pA...  (本文共71页) 本文目录 | 阅读全文>>

第四军医大学
第四军医大学

体内诱导骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损及其相关研究

关节软骨损伤的修复是骨科面临的难题之一,目前尚未得到很好地解决。传统的治疗如软骨下骨钻孔、微骨折、软骨磨削等均不能生成关节透明软骨;自体骨软骨复合物、骨膜、软骨膜或软骨细胞移植可造成附加损伤,且来源有限。近年来组织工程的发展有望成为治疗软骨损伤的新方法,但组织工程化软骨修复缺损后远期常存在修复区软骨退变。本研究将给药缓释系统引入组织工程,通过构建仿生细胞外基质支架并复合缓释细胞因子微球,体内诱导骨髓基质干细胞向软骨方向分化修复缺损并防止新生软骨远期退变。1.转化生长因子明胶微球(MS-TGF)制备及体外缓释研究目的:研制转化生长因子β1(TGF-β1)缓释明胶微球,探索将微球给药控释系统引入组织工程学领域的可行性。方法:采用改良的双相乳化冷凝聚合法制备明胶微球,将其与TGF-β1复合,观察微球分散度、粒径及外观形态;计算微球包封率、载药率及体外释药特性;分别使用缓释微球、诱导液(含TGF-β1 4.5ng/ml)诱导兔骨髓基质干...  (本文共93页) 本文目录 | 阅读全文>>

重庆医科大学
重庆医科大学

hIGF-1基因修饰骨髓间充质干细胞移植修复兔关节软骨缺损的研究

第一部分:携带hIGF-1基因重组载体的构建及在真核细胞的表达胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是在软骨发育和软骨自稳态调节中最重要的生长因子之一,能刺激软骨细胞分裂增殖,并促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白聚糖,维持软骨细胞的表型等。随着基因转移技术的发展,将外源基因导入特定靶细胞中使之高效稳定表达,进而发挥作用已完全成为可能。本实验通过构建含截短型hIGF-1基因和增强型绿色荧光蛋白标记基因的重组真核载体并检测其在真核细胞HEK293细胞的蛋白表达,为软骨组织工程种子细胞MSCs的基因修饰奠定实验基础。目的构建增强型绿色荧光蛋白基因标记的hIGF-1真核表达载体,为软骨组织工程的种子细胞MSCs的基因修饰提供方便、实用的载体工具。方法根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T18载体,测序鉴定后酶切出目的基因片段插入pIRES2-E...  (本文共133页) 本文目录 | 阅读全文>>