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人乳铁蛋白基因克隆、表达及转基因动物制备

乳铁蛋白也称乳转铁蛋白,是乳汁中主要的铁结合蛋白,广泛分布于多种组织、细胞内,具有非特异性免疫、参与铁代谢和细胞生长调节等功能。与其它动物乳铁蛋白相比,人乳铁蛋白更适于人类食用,为了满足需求,应选择合适的系统,进行人乳铁蛋白基因的异源表达。目前常用的表达系统中,动物乳腺是人乳铁蛋白基因表达较为合适的器官。因此,我们克隆了人乳铁蛋白cDNA,构建了乳腺特异表达载体,在小鼠乳腺癌细胞和个体内进行了表达,并利用精子载体法尝试了转基因兔、转基因羊的制备。首先利用RT-PCR方法从人乳腺组织中扩增出乳铁蛋白cDNA序列;PCR扩增了800bp的山羊β-乳球蛋白基因5′端调控序列。通过同源序列-PCR扩增方法连接得到的片段,酶切后克隆到表达载体中,获得人乳铁蛋白基因乳腺特异表达载体pLNCXHLF。脂质体包裹pLNCXHLF,转染小鼠乳腺癌细胞MA-782,通过G418、PCR筛选获得阳性单克隆细胞。阳性细胞用海藻酸钠包埋培养,加入激素诱导  (本文共134页) 本文目录 | 阅读全文>>

浙江大学
浙江大学

家蚕生物反应器表达人乳铁蛋白及其功能研究

人乳铁蛋白是一种多功能的铁结合糖蛋白。本研究利用家蚕核型多角体杆状病毒表达系统成功表达了重组人乳铁蛋白。本实验运用RT-PCR技术从人的乳腺组织中克隆了人乳铁蛋白(hLF)cDNA。BLAST分析测序结果表明重组人乳铁蛋白其DNA序列与GenBank中另外4个hLF cDNA序列具有高度的同源性(同源性达到99%)。序列之间的差异可能是由hLF mRNA本身的多态性造成,也可能是由于中国人hLF的特殊性引起。这些差异引起的氨基酸变化对人乳铁蛋白生物活性的影响还有待于进一步研究。将人乳铁蛋白cDNA克隆在质粒pBacPAK8的Bam HⅠ位点和Xho Ⅰ位点,构建成重组转移质粒pBacPAK-hLF。该质粒DNA与已线性化BacPAK_6 DNA共转染家蚕细胞BmN,在培养的贴壁细胞中挑出空斑,经过3轮纯化,获得重组病毒vBm-hLF。本研究利用重组病毒感染家蚕细胞和家蚕幼虫作为宿主表达重组人乳铁蛋白。经12%SDS-PAGE和W...  (本文共115页) 本文目录 | 阅读全文>>

西北农林科技大学
西北农林科技大学

腺病毒介导的人乳铁蛋白基因在兔和羊乳腺中高效表达的研究

动物乳腺被认为是生产基因工程蛋白药物的最佳场所之一,外源目标基因通过乳腺上皮细胞表达,自然分泌到动物乳汁中,从而获得所需目标蛋白。因此,研究者们在研发如何利用动物乳腺生物反应器生产转基因蛋白药物方面进行了大量探索。其主要步骤包含:(1)构建乳腺特异表达载体,在构建乳腺表达的外源基因时,外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区,即要有一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列,这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下,使其在乳腺中表达,再通过回收乳汁得到目标蛋白。(2)通过各种转基因方法将乳腺特表达载体导入原核期胚胎或体细胞,获得重组胚胎或转基因细胞;(3)将筛选正确的转基因胚胎或转基因体细胞,通过胚胎移植或核移植技术获得转基因动物个体;(4)将转基因动物个体进一步繁育,筛选检测转基因动物后代乳汁中目标蛋白基因的表达,获得稳定遗传目标基因的转基因动物。然而,现存的技术体系仍存在不可避免的缺陷:(1)需要复杂的技术...  (本文共111页) 本文目录 | 阅读全文>>

《中国食品卫生杂志》2017年03期
中国食品卫生杂志

重组人乳铁蛋白抗氧化活性研究

目的考察重组人乳铁蛋白自身及其在奶粉中的抗氧化活性。方法通过二苯代苦味肼基(DPPH)自由基抑制率、羟基自由基抑制率、超氧阴离子自由基抑制率、还原能力和抑制大鼠肝脏体外脂质过氧化等试验评价重组人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白的体外抗氧化性能。结果重组人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白的浓度与DPPH自由基抑制率...  (本文共6页) 阅读全文>>

《毒理学杂志》2017年03期
毒理学杂志

重组人乳铁蛋白大鼠致畸试验

利用转基因与体细胞克隆技术培育高效表达重组人乳铁蛋白的转基因奶牛,转基因奶牛泌乳时重组人乳铁蛋白分泌至牛奶中。通过牛奶的收集、预处理、...  (本文共4页) 阅读全文>>

《大家健康(学术版)》2015年11期
大家健康(学术版)

家蚕表达重组人乳铁蛋白及其口服治疗溃疡性结肠炎药物研究

目的:研究家蚕表达重组人乳铁蛋白及其口服治疗溃疡性结肠炎的药物治疗效果。方法:选取我院2013年10月-2014年11月间诊治的溃疡性结肠炎患者110例,将其随机分为观察组和对照组各55例,对观察组患者采用家蚕表达重组人乳铁蛋白及其口服方式治疗,对对照组患者采用柳氮磺胺吡啶治疗,对比观...  (本文共2页) 阅读全文>>