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抗TNFα抗体的体外亲和力成熟

TNF α是炎症反应的一种主要介质,在许多疾病的病理过程中起着重要作用,抗TNF α抗体对这些病理过程能起拮抗作用,从而产生治疗效果。在早期工作中,我们曾从一株单克隆抗体杂交瘤克隆出抗TNF α抗体的轻、重链可变区基因并在大肠杆菌表达了其单链抗体(ScFv)和Fab抗体。为进一步提高其亲和力,本研究尝试多种突变方法,利用抗体库技术,建立体外抗体亲和力成熟流程,此流程将适用于其它工程抗体。第一部份:随机突变提高噬菌体单链抗体的亲和力。首先对pscTNF单链抗体基因进行两轮错配PCR,构建突变库,库容为7×10~6。部份克隆测序显示碱基突变率为3.7%,氨基酸突变率为10.6%。这些突变有37%分布于CDR区,63%分布于骨架区。对此库进行四轮淘筛,获得了多株特异性结合克隆,有些结合能力有所提高,但亲和力改善不明显。为观察这些突变点重组后能否进一步提高亲和力,我们尝试了2种技术路线进行基因重组:其一,挑选了7个活性有所增强的变种克隆  (本文共59页) 本文目录 | 阅读全文>>

南京医科大学
南京医科大学

抗Met基因工程抗体的亲和力成熟与特性研究

随着恶性肿瘤对人类健康威胁的加剧,抗肿瘤研究已成为当今生命科学中极富挑战性且意义重大的领域。其中生物治疗作为手术、化疗和放疗等传统疗法外的第四种治疗手段,在肿瘤的综合治疗中发挥着愈来愈大的作用。研究发掘选择性作用于特定靶点的高效、低毒、特异性强的新型抗癌药物是当今抗肿瘤药物研究的重要方向。而以酪氨酸激酶为靶点的药物研发已成为国际抗肿瘤药物研究的热点,为此投入的研究经费也是其它任何一个非传统的肿瘤靶点药物研究所无法匹敌的。蛋白酪氨酸激酶可分为受体型和非受体型两种,它们能催化ATP上的磷酸基转移到许多重要蛋白质的酪氨酸残基上,使其发生磷酸化。蛋白酪氨酸激酶在细胞内的信号通路中占据十分重要的地位,参与调节细胞的生长、分化、死亡等一系列生理过程。蛋白酪氨酸激酶功能的失调会引发生物体内的一系列疾病。已有的资料表明,超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性,它们的异常表达将引起细胞增殖调控发生紊乱,进而导致肿瘤发生。此外,酪...  (本文共137页) 本文目录 | 阅读全文>>

第四军医大学
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人源性抗角蛋白抗体的基因克隆、表达及亲和力成熟

研究表明,人体内天然存在的抗角蛋白自身抗体(anti-keratinauto antibody,AK auto Ab)是维持机体免疫状态平衡的重要成员。一些病理情况下(如银屑病、接触性皮炎等),AK auto Ab的存在有利于限制病情的进展,促进损伤的修复,对机体具有有益的保护作用。动物实验和体外研究都提示当机体内AK auto Ab水平低下时人为补充抗角蛋白抗体有可能成为该类疾病新的治疗措施。为此我们尝试采取基因工程的方法,利用噬菌体抗体库等技术制备具有高特异性和高亲和力的人源性抗角蛋白抗体。半合成噬菌体抗体库库容4.0×10~8,经扩增后滴度为1×10~(14)cfu/ml。以人表皮角蛋白为抗原对其进行4轮“亲和吸附—洗脱—扩增”筛选,挑取单集落培养表达噬菌体抗体并鉴定其与角蛋白结合的活性和特异性;初步获得的阳性克隆经可变区基因指纹分析确定其基因种类的异同,选择不同的克隆以内切酶去除载体上的基因Ⅲ,表达可溶性Fab段,进行进...  (本文共66页) 本文目录 | 阅读全文>>

河南大学
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PD-1受体高亲和力拮抗剂药物的设计及优化

Fc融合蛋白是以人抗体的Fc片段为支架、通过连接肽合理展示具有生物学活性的多肽或功能性蛋白结构域所获得的新型融合蛋白。Fc融合蛋白的结构、功能、表达体系、纯化工艺以及药理学研究等方面与抗体药物类似,也被认为是一种广义上的抗体类药物。目前已有11种Fc融合蛋白类药物获得FDA批准上市,如依那西普、阿柏西普等。天然PD-1/PD-L1分子间亲和力约为10~(-6)M,亲和力较低,野生型PD-1或PD-L1不能有效拮抗肿瘤微环境中PD-1/PD-L1的结合,逆转免疫抑制信号。如果对PD-1或PD-L1分子进行特异性的突变改造从而提高其亲和力(例如10~(-9)-10~(-10)M),这些突变体就能够发挥与抗体类似的阻断PD-1/PD-L1信号通路的效应。而且,改造后的高亲和受体/配体结合表位与天然受体-配体的作用区域几乎完全重叠,理论上可以发挥比抗体更优的阻断效应。本论文基于天然PD-1分子的结构特征,借助计算机辅助分子模拟技术进行P...  (本文共97页) 本文目录 | 阅读全文>>

西南医科大学
西南医科大学

抗TSLP全人源重组抗体亲和力的体外成熟

目的:胸腺基质细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)于20多年前,被鉴定为小鼠胸腺基质细胞系分泌的一种细胞因子。不久后,相应的人类直系同源基因也被发现。目前,TSLP所介导的信号传导通路已被广泛研究,包括上调多种Th2相关疾病的细胞因子,如:哮喘、遗传过敏性皮炎、超敏反应,甚至有部分癌症也与之相关。所以,TSLP被认为是治疗相关疾病的潜在靶标~([1])。自1975年杂交瘤技术问世以来,人们能制备具有良好特异性的单克隆抗体。但由于此类单抗的鼠源性,在用于治疗人类疾病时,会产生强烈的人抗鼠抗体反应(HAMA)~([2,3]),导致临床应用受到限制。目前的抗体药物领域的研究热点,主要集中于利用基因工程技术,将鼠源抗体进行人源化改造~([4-6])。单克隆抗体药物的发展先后经历了鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体四个阶段~([7])。本实验平台前期构建大库容量全人源抗体文库和噬菌体展示...  (本文共93页) 本文目录 | 阅读全文>>

《中国生物工程杂志》2010年02期
中国生物工程杂志

半抗原特异性抗体的筛选及亲和力成熟

噬菌体抗体库技术的出现开创了一条便捷的基因工程抗体生产路线,为小分子半抗原抗体的制备提...  (本文共4页) 阅读全文>>