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表面活性剂辅助蛋白质复性过程机理研究

蛋白质复性技术的研究对于基因工程重组蛋白质的生产具有重要意义。本论文以天然溶菌酶为模拟体系,综合运用实验研究、结构分析和分子模拟等方法研究表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(以下简称CTAB)辅助溶菌酶复性过程的热力学和动力学特性。在此基础上,以重组人溶菌酶与重组甘露聚糖酶为实际体系,通过实验研究CTAB及其它类型折叠助剂的辅助复性效果,以考察此类技术的适用范围。第一章对蛋白质复性技术及其研究现状进行了简要综述。本章首先介绍了蛋白质复性技术研究所涉及的基本理论和实验检测方法;评述了目前发展的各种复性技术及其在基础研究和实际应用方面存在的问题;总结了表面活性剂辅助蛋白质复性技术的研究成果并重点分析了此类技术研究中存在的问题。继而提出了本文的研究设想,即从复性中间产物形成过程的分析入手来认识复性过程的热力学和动力学特性;将活性分析、结构测定和分子模拟等方法相结合来研究复性过程微观机理;采用不同的重组蛋白质产品进行复性实验以考察复性技术的  (本文共141页) 本文目录 | 阅读全文>>

天津大学
天津大学

色素亲和反胶团辅助溶菌酶复性的研究

反胶团复性法是目前国内外最为新颖的蛋白质复性方法之一,可见报道有限,其中除一篇使用的是非离子型反胶团外,其余几篇使用的都是离子型反胶团,且均未修饰亲和配基。本文利用新型的反胶团—色素亲和反胶团辅助溶菌酶复性,色素亲和反胶团是一种修饰了亲和配基的非离子型反胶团,是由亲和配基—活性色素辛巴蓝(CB)、非离子型表面活性剂—失水山梨醇三油酸酯(Span 85)、有机溶剂正己烷(n-hexane)等在一定条件下反应得到的。本文系统研究了CB/Span 85/n-hexane系统辅助溶菌酶复性的实验方法以及操作参数的影响,包括Span 85、CB、脲、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、还原型谷胱甘肽(GSH)、溶菌酶的浓度,pH值,反胶团含水率(W_0),反应时间等。成功实现了较高浓度(3~3.5 mg/mL)溶菌酶的完全复性,体现出反胶团法较直接稀释法的巨大优势,以及非离子型亲和反胶团较单纯非离子型反胶团在复性效果方面的较大优势;同时保证95%...  (本文共69页) 本文目录 | 阅读全文>>

中国人民解放军军事医学科学院
中国人民解放军军事医学科学院

基于凝胶电泳的蛋白质组研究策略及应用

人类基因组全序列测定的完成,标志着一个崭新的时代—后基因组时代的来临。生命科学从大规模的基因组序列分析转向对基因功能的研究,蛋白质组学研究已成为21世纪生命科学的热点领域。开展大规模蛋白质组研究的必备条件是高分辨蛋白质分离技术和高通量、高灵敏度的鉴定技术。因此在本研究的第一部分首先优化了碱性蛋白质和超放大窄范围胶(Zoom gel)的二维电泳(2-DE)分离条件,并利用优化后的参数,建立高分辨胎肝全蛋白2-DE表达谱,分辨蛋白质点达到5487个。随后,探索了胶内蛋白质鉴定的策略,建立了基于2-DE的高通量胶上蛋白质点鉴定技术。同样,在本研究的第二部分优化了一维凝胶电泳和液相色谱串联质谱联合的复杂蛋白质混合物鉴定技术。利用上述建立的蛋白质组学研究技术体系,开展人胎肝蛋白质组表达谱研究。4-6月孕龄的人胎肝除具备正常肝生理功能外,还是胚内至关重要的造血器官,造血、免疫系统干祖细胞的主要来源。大规模的胎肝蛋白质组分析,将很有可能发掘与...  (本文共124页) 本文目录 | 阅读全文>>

浙江大学
浙江大学

加压CO_2-乙醇-水体系等电沉淀蛋白质过程的研究

以高附加值蛋白质的分离、纯化为背景,在新近兴起的加压CO_2-水溶液体系等电沉淀技术的基础上,引入助沉淀剂——乙醇,形成加压CO_2-乙醇-水溶液体系沉淀蛋白质技术。该方法具有环境友好、过程可控性强等特点,符合生物分离技术的发展趋势,具有潜在的实用价值。首先,以碱性蛋白酶2709~#粗品为对象初步考察了加压CO_2-乙醇-水溶液体系沉淀蛋白质技术的可行性和规律。结果表明,用该技术可以实现对碱性蛋白酶2709~#粗品的除杂。体系pH值较低时,会出现酶分解的现象,但通过控制操作条件可保持酶的相对稳定。CO_2压力、酶液的初始pH值、酶浓度和乙醇含量会影响溶液pH的变化和沉淀现象;操作温度对其影响不大。处理时间、CO_2压力、酶液的初始pH值、酶浓度、乙醇含量等参数会影响操作过程中蛋白质的稳定性。第二,通过考察温度、初始pH值、乙醇含量三个参数对加压CO_2-乙醇-水三元体系的影响得知,温度、乙醇浓度对体系pH值随压力变化情况影响不大...  (本文共141页) 本文目录 | 阅读全文>>

天津大学
天津大学

辅助因子促进蛋白质复性的研究

蛋白质的体外复性研究不仅对基因工程重组蛋白质的生产具有重要意义,而且对探索蛋白质错误折叠导致疾病的机理也具有积极的指导作用。本文以变性还原溶菌酶为模型蛋白质,研究了不同折叠辅助因子对促进蛋白质复性的作用;复性动力学特性;以及辅助因子与色谱耦合作用提高蛋白质复性收率的途径。首先研究了分子伴侣,固定化分子伴侣以及固定化分子伴侣色谱辅助蛋白质复性特性。结果表明,在1 mol/L的最佳盐酸胍浓度下,固定化分子伴侣色谱法的最高复性收率可达到97%,复性产率达到54 mg/L.h,是尺寸排阻色谱法的4倍,证明固定化分子伴侣色谱复性方法在高通量复性方面具有明显的优势。为了解明分子伴侣辅助蛋白质复性的动力学特性,建立了分子内折叠与分子间聚集的竞争反应动力学模型。模型分析表明,分子伴侣的存在可有效抑制聚集体的生成,降低聚集体反应级数(为2级反应);三磷酸腺苷(ATP)作为多肽链释放驱动剂是十分重要的,GroEL和ATP的同时作用可提高复性速率2倍...  (本文共132页) 本文目录 | 阅读全文>>

大连理工大学
大连理工大学

疏水作用层析及其渗透质辅助包涵体蛋白质复性的研究

包涵体蛋白质体外折叠复性是基因工程下游的瓶颈之一,采用传统的稀释复性方法复性包涵体蛋白质容易形成聚集体和错配体,复性后的蛋白质很难在高浓度下得到高活性回收率。本论文的目的在于利用疏水作用层析技术开发一种新的疏水作用层析辅助包涵体蛋白质复性方法,实现蛋白质在高浓度下的高活性和高回收率。本论文分为四个部分。第一部分对复合干扰素的稀释复性条件及复性方法进行了优化,考察了聚乙二醇、甘油等渗透质以及Butyl FF、Phenyl FF、PorosET和Poros PE等疏水层析介质作为添加剂对复合干扰素稀释复性的影响,总结出Poros ET/10%PEG混合体系为最佳,复性蛋白收率为74.6%,比活为2.61×10~8U/mg,分别高于对照组的45.4%和2.1×10~8U/mg。第二部分应用反相高效液相层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、氧化型/还原型SDS-PAGE电泳以及质谱二硫键定位等方法对稀释复性复合干扰素的各构型体进行分析,建立...  (本文共124页) 本文目录 | 阅读全文>>

天津大学
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蛋白质吸附平衡和动力学理论研究

蛋白质的离子交换平衡和动力学行为在生物分离过程的设计和优化中起着十分重要的作用。然而,离子交换色谱理论尚不完善,围绕蛋白质离子交换色谱理论,本文展开了以下的研究工作:1.采用统计热力学模型(ST模型)研究了蛋白质(BSA和Hb)在阴离子交换剂DEAE Spherodex M上的吸附平衡行为。结果表明,ST模型可以很好地描述不同离子强度条件下单组分和双组分蛋白质的吸附平衡行为。随着离子强度增高,吸附相伴离子对蛋白质与吸附剂之间和蛋白质分子间静电力的屏蔽作用增大。在相同的离子强度条件下,BSA与DEAE Spherodex M之间的静电引力较强;BSA分子之间的静电斥力大于Hb分子之间的静电斥力。在相同的离子强度条件下的Hb-BSA双组分吸附体系中,BSA与吸附界面静电吸引作用强,吸附竞争力强。由ST模型参数1/αi和k ii分别计算得到蛋白质的有效电荷数基本一致。2.采用ST模型进而研究了BSA和Hb在阳离子交换剂SP Sepha...  (本文共146页) 本文目录 | 阅读全文>>