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鸡输卵管组织特异性基因打靶载体的构建及诱导鸡免疫耐受模型的建立

二十多年来,用转基因动物生产药物蛋白已经取得了突破性进展,具有广阔的应用前景。与哺乳动物相比,禽类具有个体小,繁殖率高,世代间隔短,蛋中可以获得目的基因产物等优势。但是由于禽类的独特的生殖生理特点,鸡输卵管生物反应器的开发相对落后。本研究首先构建了鸡输卵管组织特异性基因打靶载体和分泌型融合表达载体,将后者转染鸡法氏囊淋巴细胞(DT40)系,筛选得到了可稳定表达并分泌人Leptin和GFP的细胞,为转基因鸡的研究和输卵管生物反应器的制备奠定了基础。同时,为了解决外源基因产物引起宿主免疫应答的问题,本文通过在鸡胚发育早期的不同阶段,采用胚胎血管微注射和卵黄注射两种方式,将外源蛋白抗原引入鸡胚,诱导了出生后小鸡对同种抗原的免疫耐受,获得了完全免疫耐受和部分免疫耐受的个体。1.鸡输卵管组织特异性基因打靶载体和分泌型融合表达载体的构建用PCR的方法,扩增本实验室已构建的含卵清蛋白基因5’调控序列及溶菌酶基因序列的载体pOVALG,得到1.  (本文共112页) 本文目录 | 阅读全文>>

中国海洋大学
中国海洋大学

花鲈肌肉生长抑素基因(MSTN)克隆、表达及其基因打靶载体的构建

本研究采用同源克隆和染色体步移的策略首次分离、克隆了5396 bp的花鲈MSTN基因组序列。花鲈MSTN基因具有3个外显子,2个内含子,整个开放阅读框编码着374个氨基酸,具有9个保守的半胱氨基酸及一个RVRR的蛋白酶解加工位点。通过RT-PCR分析表明MSTN基因在花鲈肌肉、脑、眼睛中表达量最高,其次是小肠,鳃、脾脏、肝脏和心脏中只有极少量表达;在早期的胚胎发育中,直到孵化后15天的仔鱼才检测到MSTN的表达;在不同细胞系中,MSTN在花鲈胚胎干细胞(LJES1)中表达,但在其它几个花鲈体细胞系(上皮、成纤维、淋巴样细胞)中都没有检测到表达。此外,我们用1125 bp MSTN的5’启动子区域与GFP基因连接,构建了pMSTN-GFP质粒。将pMSTN-GFP转化LJES1细胞,获得了表达;通过显微注射,将pMSTN-GFP质粒转入斑马鱼1细胞期的胚胎,在孵化后10天左右的仔鱼躯干部检测到了绿色荧光的表达。为了提高外源基因转化...  (本文共116页) 本文目录 | 阅读全文>>

暨南大学
暨南大学

TALEN介导的E-cadherin、Bmi-1基因联合干预鼻咽癌转移的体外研究

目的:该研究旨在体外建立类转录激活因子效应物核酸酶(简称TALEN)介导的E-cadherin(简称E-cad)、Bmi-1基因联合干预鼻咽癌细胞CNE-2转移的技术,为鼻咽癌的基因治疗提供实验基础。方法:在本课题组前期构建的通用多位点基因打靶载体pUC-DS1-DS2的基础上,通过In-fusion技术分别插入E-cad表达元件、Bmi-1 shRNA表达元件,构建多位点基因打靶载体pUC-DS1-CMVE-cad-2A-Neo-DS2、pUC-DS1-Bmi-1 shRN A-Zeo-DS2,将E-cad基因打靶载体、Bmi-1 shRNA基因打靶载体分别或共同与本课题组前期构建的TALEN转染鼻咽癌CNE-2细胞株,PCR检测靶基因的整合情况,Western Blot检测E-cad和Bmi-1蛋白表达以及上皮间质转化(EMT)标志蛋白(Vimentin、α-1-Catenin、Fibronectin)的表达情况,Trans...  (本文共71页) 本文目录 | 阅读全文>>

《中国医科大学学报》2015年03期
中国医科大学学报

小鼠性激素结合球蛋白条件基因打靶载体的构建

性激素结合球蛋白(sex hormone-binding globu-lin,SHBG)是一种能结合性激素甾体的球蛋白,主要由肝脏组织细胞合成和分泌,在其他组织中如睾丸、脑、卵巢、胎盘、子宫内膜和乳腺癌组织也有SH-BG基因表达[1]。妊娠期糖尿病的发病机制与2型糖尿病相似,妊娠期胰岛素抵抗的增加和胰岛β细胞分泌的减少也是其发病的病理生理基础。目前认为SHBG的低水平是2型糖尿病发生的独立危险因素,是高胰岛素血症性胰岛素抵抗的一个标志[2]。最近研究发现,SHBG基因启动子(TAAAA)_n重复多态与糖代谢异常有关,这种重复多态性可以影响血液循环中的SHBG水平,对易发生糖尿病等并发症的高危个体的早期识别具有重要的价值[3,4]。我们通过RNA干扰与基因沉默技术研究了胎盘滋养层合体细胞中SHBG的自分泌作用机制;通过胎盘滋养层合体细胞胰岛素抵抗模型的建立,研究了SHBG对其胰岛素信号的转导和胰岛素抵抗的影响[5~7]。目前利用基...  (本文共7页) 阅读全文>>

《生物工程学报》2008年10期
生物工程学报

通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定

转基因动物在基因功能研究、人类疾病模型建立、乳腺生物反应器的研制及家畜的转基因育种等研究领域中都有重要的意义[1?6]。克隆羊多莉的诞生[7],使以体细胞为遗传操作单元的转基因细胞制作结合体细胞核移植技术生产转基因动物成为可能,其中供核转基因细胞的制作中转基因载体的构建是其关键步骤之一。目前应用于转基因细胞制作的载体主要有病毒载体、普通质粒载体及基因打靶载体。其中病毒载体因其高效的感染性受到许多学者的青睐,但病毒载体存在插入位点的不可预测性和承载外源基因长度有限的问题;普通质粒载体虽然有较大的承载量,但存在整合效率低和多拷贝插入的缺陷;而基因打靶载体可对细胞进行单拷贝基因定位修饰,并且能够稳定的遗传。迄今为止用基因打靶的方法已经生产出了转基因牛、羊、鼠[2,6?8]。基因打靶技术的关键步骤之一是基因打靶载体的构建,Mansoor等[9]提出的正负筛选基因打靶策略能很好的筛选打靶成功的细胞克隆,正选标记基因用于筛选阳性克隆,负选标...  (本文共6页) 阅读全文>>

《吉林大学学报(医学版)》2006年06期
吉林大学学报(医学版)

小鼠釉基质丝氨酸蛋白酶基因打靶载体的构建及鉴定

釉基质丝氨酸蛋白酶(enamel matrix serineproteins 1,EMSP1)是成釉细胞分泌的釉基质特异蛋白水解酶,最早由Fukae等从猪釉基质中分离得到[1]。其主要分布于成熟早期釉基质,具有水解釉基质的主要成分-釉原蛋白的功能。EMSP1的功能完善与否,将直接影响釉基质能否完全矿化成熟,如果釉基质降解不完全则将导致釉质矿化不全(amelogenesis imperfecta,AI)[2]。对EMSP1的研究有助于探明釉质矿化成熟机制。同时,EMSP1也是目前第一个从蛋白质和DNA水平上分离和定性的釉基质蛋白酶[3],因此越来越受到学者们的关注。在釉基质蛋白水解过程中发挥作用的是2种蛋白酶:基质金属蛋白酶20(matrixmetalloproteinase-20,MMP-20)和EMSP1,越来越多的证据表明后者在釉基质水解过程中起着主要的作用[4]。目前,已经用基因打靶的方法建立MMP-20基因敲除小鼠,发现...  (本文共4页) 阅读全文>>