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大肠杆菌无细胞系统合成人β-防御素和艾滋病病毒蛋白的研究

近年来一种以外源mRNA或DNA为模板,通过在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量物质来合成蛋白质的体外蛋白质合成系统越来越引起重视。与传统的体内系统相比,无细胞系统具有众多的优越性:1)反应简便,只需加入抽提物、DNA模板和各种必需的反应底物,就可以表达目的蛋白;2)可用于表达在体内系统中难于表达的蛋白质,如对细胞有毒害作用的抗菌肽和膜蛋白等;3)能够直接以PCR产物作为线性模板在微孔板上同时平行合成多种蛋白质,能够满足高通量药物筛选和蛋白质组学研究等的需要。人β-防御素是近年来发现的具有广谱抗菌活性并在机体抵御外来微生物入侵中起防御作用的一类阳离子抗菌肽。有望成为解决致病菌耐药性问题的新型内源性抗生素,并被证明具有抑制艾滋病病毒复制的作用。分别对从人体炎症皮肤组织中通过RT-PCR方法克隆获得的人β-防御素-2(HBD-2)人源基因、经密码子优化后的HBD-2人工合成基因构建了HBD-2的表达载体,得到了一系列不同密码子来源或带  (本文共152页) 本文目录 | 阅读全文>>

《生物化学与生物物理进展》1980年50期
生物化学与生物物理进展

无细胞系统的基因表达与蛋白质合成

利用重组DNA技术在宿主细胞内表达外源的或合成的基因常常受到许多因素的限制.主要有:a基因表达产物的不溶性和不稳定性;b细胞内蛋白酶对产物的降解;c某些产物对宿主细胞有毒性;d在原核细胞表达系统,产物易形成不溶性的包涵体,需要变性和重新折叠;e宿主细胞本身的基因调控机制在一定程度上要影响外源基因的有效表达等.而无细胞系统易于解决上述问题,因而在研究外源基因表达与蛋白质合成方面比传统的体内细胞表达系统具有更大的优越性.最初建立的标准无细胞系统,因采用分批方法,具有反应时间短(1h左右)和产物得率低(<2g/ml)两个致命的缺点,严重阻碍了它的应用.1988年,前苏联学者Spirin等[1]建立了一种可使外源基因高效表达的连续流动无细胞系统(continuousflowcelfresystem,CFCF系统).即含有氨基酸、ATP和GTP等物质的供给液通过蠕动泵连续恒速流入反应系统,同时产物也以相同的速度经超滤膜滤出,使其...  (本文共4页) 阅读全文>>

浙江大学
浙江大学

以大肠杆菌或家蚕丝腺为基础的无细胞系统的构建

伴随着大量生物遗传信息的被人类解读出来,一种可以快速、高通量合成蛋白质的方法成为了一种迫切的需求。无细胞蛋白质合成系统由于蛋白质合成能力强、操作快速简单、适于高通量表达各种蛋白质受到广泛关注。本论文研究的目的就是通过优化大肠杆菌无细胞抽提物的制备方法降低无细胞系统的制备成本,提高蛋白质合成能力,为无细胞系统的广泛应用打下基础;同时,尝试利用家蚕丝腺构建的新的无细胞蛋白质合成系统,拓展制备无细胞抽提物的细胞来源,并在真核蛋白质的体外合成方面有广阔前景。本论文选择eGFP作为报告基因,利用pIVEX2.4c作为大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统的表达模板构建表达质粒PIVEX2.4c-eGFP。选择E. coli BL21(DE3)作为制备无细胞抽提物的菌种,测定其生长曲线,确定细胞生长的对数生长期。优化大肠杆菌无细胞抽提物的制备流程,简化操作步骤和成本,提高蛋白质合成能力,eGFP表达量可以达到427μg/mL。这是国内首次报道通过改进...  (本文共80页) 本文目录 | 阅读全文>>

《生物物理学报》1950年40期
生物物理学报

染色质在非洲爪蟾卵的无细胞系统中形成组装核的研究

染色质在非洲爪蟾卵的无细胞系统中形成组装核的研究许怀庆,陈楚楚(中国科学院生物物理研究所北京100101)摘要从大鼠肝、鸡肝提取了染色质并从受精未孵育鸡蛋胚下表层卵黄颗粒提取了染色质,在荧光显微镜和电子显微镜下观察了这些染色质在无细胞系统中形成的组装核;研究二价钙镁离子对形成组装核的影响。在有ATP再生系统存在的无细胞系统中,围绕染色质能形成与间期细胞核相似的组装核;二价钙离子不利于形成组装核,而二价镁离子是形成组装核所必须的,但过高浓度的镁离子对形成组装核有抑制作用。关键词:染色质,组装核,无细胞系统,钙离子,镁离子近年来,国内外许多实验室都相继建立了无细胞系统,将外源的LaTnbdaDNA、去膜精核、HeLa细胞的中期染色体,甚至SV40的病毒DNA引人此系统中,都成功的诱导了细胞核的自组装。组装核具有典型的双层膜、核孔复合体、核纤层以及前核仁体(PI?ellllcler)lar*4林等结构,且具有一定的生物学功能,如:在一...  (本文共7页) 阅读全文>>

《氨基酸杂志》1985年04期
氨基酸杂志

几种mRNA在无细胞系统中的翻译

信使核糖核酸(mRNA)的分离与测活,在基因表达与调控、核酸结构的分析、以及基因工程等方面的研究中占有特殊的地位。一个目的基因的分离可以通过mRNA逆转录成cD NA而钩出此基因,所得基因可以进行核普酸的序列分析,同时还可以进行调控序列的分析;又如可以借助mRNA探针从基因文库中钩出目的基因;也可以通过mRNA筛选出所需要的克隆。因此二RNA的研究已成为分子生物研究中重要手段。 为使麦胚(或玉米胚)无细胞系统确能有效地显示出外源二RNA的模板作用,我们制备了纯的血红蛋自mRNA(HbmRNA)白蛋白mRNA等,并对此无细胞系统中若于因素作了测定与分析,以便找到一种适宜于真核生物mRNA翻译的条件。材料与方法 材料 家兔(新西兰大白兔),健康正常纯系,体重两公斤以上供贫血试验用,和大鼠其种属来自生物制品所。来杭鸡取自本校生物系鸡场。 “农大139,,麦种取自北京农大 “金黄皇”玉米取自湖北农科所 试别 01190(dT)一纤维素(...  (本文共5页) 阅读全文>>

《生物技术通报》1996年06期
生物技术通报

激素和活性多肽

应混合物中合成蛋白。棍合物含有0,2山M氛墓酸(共20种);1.2加碗八砰;住即、(江下和Ul下各0.75垃M;27n1M磷酸始醉丙附酸泊.17rng/xul留洲A;0.641llM cAMP;34.6四入川亚叶酸;1.9%PEG一6以犯;1.75n它涯二硫苏搪醉;n.7口M峋(O叭亡)2;肠血MN践Ac;72mM[KQ灿;9.7n1MQ(OAe)幻56:4加MT肠s一乙酸(pHS.2);编码(工)和(n)的质粒p叨M叫CF或质粒户,N田£叫FDNA;和5川匀O提取物。(王颖)962162调节仲启劝子以住皿组E.叻”在批式供给发辞过程中生产牛粉体生长徽众[英〕/Ydl,5.K.…仍.F即m巴七肠呻堪;,199石,81(2).一153一157【译自DBA,1996,15(8),96一04393纽在37℃、过程中研究重垂体生长激素。n条件下的14升批式培养一、W3llD巾饵奴已盯产生牛中的T印启动子调节间题。962161用一种无细胞...  (本文共3页) 阅读全文>>