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人视网膜色素上皮细胞吞噬功能与MERTK基因表达及蛋白激酶C调控关系的研究

目的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)的吞噬功能对维持正常视觉功能至关重要;该功能障碍时引起视细胞外节盘膜(rod outer segment,ROS)的堆积而导致严重的视网膜变性类疾病。目前对该细胞的吞噬机理尚未十分清楚,进一步探讨吞噬功能及其机制,将对这类疾病的预防和治疗带来希望。RCS鼠(royal college of surgeons rat)作为一种典型的隐性遗传性视网膜变性模型近年来得到了广泛的研究。研究发现,RCS鼠Mertk基因发生了突变,从而导致RPE细胞摄入ROS的过程无法启动。同时,研究还显示,与具有正常视网膜功能的LongEvens鼠比较,RCS鼠RPE细胞的某些细胞信号转导功能也存在异常,如蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)协同受体蛋白酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase,RPTK)调节L型Ca  (本文共77页) 本文目录 | 阅读全文>>

中国医科大学
中国医科大学

I型蛋白激酶A在口腔鳞癌中的表达和活性研究

前言口腔鳞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,其发生率约占癌瘤的80%以上。由于鳞癌发生的部位不同,其组织结构、恶性程度、转移部位及治疗方法等方面也均有所不同。蛋白激酶A(Protein Kinase A, PKA)为依赖cAMP(环腺苷酸,cyclic adenosine monomphsopate)的蛋白激酶,有传递胞外的刺激信号,影响膜蛋白的磷酸化而改变细胞膜的通透性,调控细胞的增殖、分化和凋亡等作用。因此蛋白激酶A的调控障碍在细胞的异常生长和增殖中起到了重要作用。蛋白激酶A有两种亚型,即Ⅰ型蛋白激酶A(PKA Ⅰ)和Ⅱ型蛋白激酶A(PKA Ⅱ)。PKA Ⅰ作为cAMP的主要调节子,近年来关于其在肿瘤方面的研究越来越多。许多证据显示PKA Ⅰ在癌细胞系、原发性肿瘤和增生过度的细胞中呈过度表达。本实验应用免疫组织化学、Western blot和检测同位素放射,对PKA Ⅰ在口腔鳞癌中的表达和活性进行研究,探讨PKA Ⅰ与口腔鳞癌...  (本文共42页) 本文目录 | 阅读全文>>

中国农业大学
中国农业大学

葡萄果实中脱落酸激活的钙依赖蛋白激酶:纯化、测序及定位

脱落酸(ABA)是果实发育的一个重要调节因子,对其调控果实生长发育机制的研究,很重要的一方面是对其信号组分的鉴定。蛋白激酶所催化的蛋白质磷酸化过程在细胞信号转导中起关键的作用,因此,鉴定与ABA信号转导相关的蛋白激酶,对于揭示果实发育中ABA作用的细胞和分子机理具有重要意义。钙依赖的蛋白激酶(CDPK)是植物中特有的一种蛋白激酶,但是,据我们所知,目前ABA信号通路中CDPK的作用仍不清楚,所以,本研究具有更广泛的科学意义。本实验应用胶内蛋白激酶自磷酸化分析表明,在葡萄果实微粒体中存在一种分子量约为62.5KD的钙依赖的蛋白激酶(CDPK),并且,外源ABA处理能激活这一蛋白激酶。由于CDPK和信号转导有关,是一种重要的信号分子,因此我们将实验的重点放在了这个蛋白激酶的纯化上。制备葡萄果实微粒体,经过大量的SDS-PAGE电泳,将目的蛋白从胶上洗下来,低压冷冻干燥、富集,得到了电泳纯的目的蛋白。应用双向电泳(two-dimens...  (本文共80页) 本文目录 | 阅读全文>>

武汉大学
武汉大学

烟草钙依赖型蛋白激酶生化及表达分析

以玉米MCK1为探针筛选烟草的cDNA文库,得到两个高度同源的全长cDNA序列。本课题就以鉴定这两个cDNA所编码的蛋白质NtCPK4和NtCPK5为中心,开展了一系列的研究。首先分析了这两个蛋白质的氨基酸序列,发现它们编码两个高度同源的钙依赖型蛋白激酶。对于这两个蛋白激酶首先进行了酶活分析,确定其酶活依赖于Ca~(2+),并进一步分析了它们的酶活动力学常数。用毛细管电泳的方法鉴定了一个蛋白激酶的磷酸化的氨基酸。并对其中的一个基因进行了表达分析,采用的方法是以基因特异的序列为探针进行RNA原位杂交和Northern Blot分析。以GFP为标签,用基因枪转化洋葱表皮进行瞬时表达分析,表明NtCPK4和NtCPK5具有完全不同的亚细胞定位模式,进一步的点突变实验证明了N端可变区在蛋白激酶的亚定位中发挥重要的作用。1.经序列分析表明,这两个cDNA均含有完整的阅读框,编码的蛋白具有钙依赖型蛋白激酶的保守结构域,即激酶区、自抑制区和钙...  (本文共142页) 本文目录 | 阅读全文>>

中国科学院研究生院(上海生命科学研究院)
中国科学院研究生院(上海生命科学研究院)

蛋白激酶C-βΙ和-δ在脂肪细胞分化中的作用

蛋白激酶C (PKC)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员,在多种细胞生理功能中起着广泛而重要的作用。然而PKC在脂肪细胞分化中的调节作用仍然不是很清楚。在本工作中,我们研究了几种PKC亚型在3T3-L1前脂肪细胞分化中的作用。3T3-L1前脂肪细胞可经地塞米松,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和胰岛素诱导分化成为成熟的脂肪细胞。我们发现PKC的非特异性抑制剂R?318220能够抑制3T3-L1的脂肪细胞分化。并且, PKC-α, ?βΙ,和-μ亚型的选择性抑制剂G?6976也抑制3T3-L1的脂肪细胞分化。若用PPARγ的激活剂troglitazone预处理细胞,脂肪细胞的分化不再被G?6976所抑制。在脂肪细胞分化的前两天,PKC-βΙ发生膜转位,而未发现有PKC-α和-μ的膜转位。过量表达PKC-βΙ显性功能失活突变体也抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化,但该抑制可以被troglitazone所逆转,提示PKC-βΙ是脂肪细胞分化...  (本文共72页) 本文目录 | 阅读全文>>

昆明医学院
昆明医学院

蛋白激酶C-βⅡ对人原发性肝癌细胞影响的实验研究

【目的】研究观察蛋白激酶C-βⅡ对人原发性肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。【方法】本实验采用两部分进行即体外部分和体内部分。体外实验:体外培养人原发性肝癌细胞(PHC)SMMC-7721细胞,质粒(PKCβⅡ)大量制备,脂质体介导基因体外转染,应用细胞计数、蛋白激激酶C-βⅡ测序、细胞形态学观察、MTT法、流式细胞仪(FACS)检测技术等方法研究PKCβⅡ对人原发性肝癌细胞的影响,并进行统计学分析。体内实验:3至4周Nu/nu系健康裸鼠30只,随机分成空白组、对照组、实验组。在30只裸鼠背部注射入人原发性肝癌细胞SMMC-7721细胞,使其背部长出肿瘤,并分别注射入生理盐水、pcDNA3、PKCβⅡ,隔天注射一次,并记录每次肿瘤的大小,待注射药物十五次后,处死裸鼠,取裸鼠背部肿瘤,4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片,应用细胞周期素D1(Cyclind1)、基质分解素-1(MMP_3)、基质金属蛋白水解酶-9(MMP_9...  (本文共45页) 本文目录 | 阅读全文>>