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大熊猫基因资源库构建及粪便高质量DNA提取方法的建立

1.本文以大熊猫的成纤维细胞和肝组织细胞为材料,以pBeloBAC11为载体,构建了大熊猫基因组的细菌人工染色体DNA文库。该文库包含了93700个克隆,分别保存于977块96孔细胞培养板中。经过对100个随机抽样的克隆分析表明,插入片段的平均大小为160kb,相当于大熊猫基因组的5倍,即5个库容量。酶切10个克隆证明,经过100代繁殖后,其插入片段仍稳定不变。2.采用RNeasy Mini Kit提取大熊猫肝脏和脑组织的总RNA,经oligotex试剂盒纯化得到mRNA。利用SMART(switching mechanism at 5'end of RNA transcript)技术,构建了肝脏和脑组织的全长cDNA文库。在构建完成的文库中,肝脏文库含有约5.0×10~6个重组子,而脑组织文库含有约3.5×10~6个重组子。在2个文库中,插入的cDNA长度为400bp—4kb,重组率高达90%以上。鉴定结果表明,大熊猫肝脏和脑  (本文共85页) 本文目录 | 阅读全文>>

河北医科大学
河北医科大学

食管癌细胞MT-3基因CpG岛超甲基化的意义以及食管癌组织DNA提取方法的优化

目的:我国是食管癌的高发国家,特别是河北南与河南北部,食管癌病死率为全球最高的地区之一,因此,深入研究食管癌的发病机制,以有效地对其进行预防和治疗,在该地区殊为重要。与其它恶性肿瘤一样,食管癌的发生是多种癌基因的激活与抑癌基因的失活长期协同作用的结果。基因异常甲基化是目前所知的除突变、缺失和移位之外的另一种基因异常改变,与其它基因异常相比,基因的甲基化研究不仅对恶性肿瘤的病因、早期诊断及预后评价有很大价值,而且对肿瘤的基因治疗研究有着重要的作用。目前已知,食管癌的发生与p16(INK4a)等多种基因的异常甲基化有关。MT-3基因是细胞内一种金属硫蛋白的编码基因,不仅具有许多重要的生理功能,还可以抑制细胞增殖,已有研究发现MT-3基因在胃癌中存在异常甲基化,但该基因在食管癌中的甲基化情况尚无人研究。本课题应用COBRA分析和RT-PCR方法检测食管癌细胞株、新鲜食管癌标本及食管癌标本的石蜡包埋组织中的MT-3基因的甲基化情况及其对...  (本文共130页) 本文目录 | 阅读全文>>

《文物鉴定与鉴赏》2018年03期
文物鉴定与鉴赏

DNA提取方法及在古DNA研究中的应用

我国墓葬、考古遗址中经常发掘出土大量猪、马、方法:以血液DNA提取为例。取微量血液用约400μl牛、羊等动物遗骨遗骸、古尸以及植物残留[1-6],这些遗存纯水震荡破碎红细胞;13,000r/min离心去上清,收集沉为我们提供了古代动物、植物和人类重要的基因信息。古淀;向沉淀中加入200μl5%…Chelex-100溶液(使用前要DNA是古代生物的信息载体,作为分子生物学研究的一个充分振摇),在振荡器上反复振荡,放入56°C保温30min工具,在建立DNA动力学模型、探索环境改变与生物多样以上;取出后振荡混匀,100℃保温8min,振荡后,13,性的关系、详述灭绝动物的饮食、验证过去群落结构和基000r/min离心3min,上清用于PCR扩增,或放4°C保存因流动障碍、表现生物两性的特性、推断古代和现代人类备用。传播模式、澄清系统发育关系、阐明进化发育生物学等方应用:Chelex-100法适用于血迹、混合斑、毛根、面已经得到了广泛...  (本文共4页) 阅读全文>>

《食品与药品》2018年03期
食品与药品

深加工阿胶制品DNA提取方法对比探究

在驴皮资源缺乏、原料供应严重不足等原因的影响下,出现了以其他动物廉价皮冒充驴皮等故意制假售假现象,致使阿胶相关产品质量问题较为突出。而其真伪的鉴定,关键是高质量、高纯度阿胶样品DNA的获取。阿胶制品高质量DNA的获得是其后续PCR鉴定实验的前提和保障。对于深加工阿胶制品而言,蒸、煮等深加工过程对DNA链的破坏较为严重,且驴皮原料中含大量的胶原蛋白及纤维,更进一步加大了DNA提取的难度,得到的基因组质量很难满足PCR实验需求[1-3]。目前,动物组织的DNA提取方法多种多样[4-12],其中使用范围较广、频率较高的主要有十二烷基磺酸钠(SDS)法、异硫氰酸胍法、试剂盒法及基于以上方法的改良方法。针对深加工阿胶制品,上述方法都具有各自的局限性,很难得到高品质的DNA。因此建立一种稳定且高质量的DNA提取方法是进行阿胶相关产品源性成分真伪鉴定的重要环节。本研究采用5种方法对阿胶深加工制品进行DNA提取,并从DNA纯度、浓度、PCR和荧...  (本文共5页) 阅读全文>>

《实验技术与管理》2017年12期
实验技术与管理

小鼠粪便细菌基因组DNA提取方法比较

肠道是哺乳动物体内最大的消化器官,其中含有数量巨大的细菌菌群,形成了极其复杂的细菌微生态系统,肠道微生态系统中的菌群结构、数量和种类的变化与机体的健康和疾病有着密切的关系[1-2]。粪便的主要成分是微生物的菌体和食物残渣,其中包含着重要的肠道微生物信息,可以间接地反映肠道微生物的变化情况。近年来随着分子生物学研究和技术的发展,利用分子生物学技术和方法从粪便中提取肠道微生物总DNA,并对相关疾病进行研究取得了许多突破[3-4]。但是粪便中含有的成分非常复杂,其中含有的色素、多糖和纤维素等物质对Taq DNA聚合酶有抑制的作用;脂类、酸类、多酚等有机物在DNA提取过程中很难去除,这些杂质不但易导致目标DNA的降解,还直接影响到后续研究的准确性。因此,以粪便为标本提取细菌基因组DNA进行肠道微生态研究的关键是能否提取到高质量的粪便细菌基因组DNA[5]。本研究是在已有报道的基础上比较几种小鼠粪便细菌基因组DNA提取方法,旨在保证提取效...  (本文共5页) 阅读全文>>

《中国真菌学杂志》2017年06期
中国真菌学杂志

一种简便、快速、高效适合PCR的真菌DNA提取方法

[Chin J Mycol,2017,12(6):359-361]临床常见真菌主要是通过形态观察进行鉴定,但该方法培养时间长,且形态比较接近的真菌难以判定;且有的真菌受某些因素影响导致产孢结构不明显,更难通过形态学进行鉴定。因此,通过分子生物学方法[1]进行真菌鉴定显得越来越重要,真菌ITS[2]序列含有保守区和高度可变区,常用来进行真菌测序鉴定。然而真菌细胞壁成分复杂,富含多糖、色素、核酸酶等物质,使得真菌DNA提取比较困难;传统DNA提取方法繁琐,且比较费时,所以探索临床常见真菌DNA快速、高效的提取方法十分重要。现有研究表明,酶解消化[3-5]提DNA效率较高,Chelex-100[6-8]可以有效避免DNA在提取过程中的降解,适用于快速提取DNA。因此,本文将两者结合起来,以期探索一种更为高效的DNA提取方法。1材料与方法1.1材料实验菌种实验选用临床收集到的且均通过ITS基因测序鉴定的真菌共34株,涉及近30个不同属的...  (本文共4页) 阅读全文>>