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转基因鱼腥藻7120质粒稳定性研究及rhTNF-α表达的发酵条件优化

α型肿瘤坏死因子(α-TNF)是巨噬细胞产生的一种细胞因子,因具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等多种生物学活性及功能,而具有广阔的临床应用前景。由于自然来源有限,重组TNF和其衍生物的研究迅速发展,其中由于蓝藻具有的诸多优点,如不含毒蛋白,本身富含多种保健成分,易培养等,使开发其成为TNF的新型宿主具有很好的商业价值。本研究在前人的基础上,得到已转入hTNF-α基因的鱼腥藻7120,为了产生更好的经济效益,研究了重组质粒的稳定性及其光异养和各种环境因子对其生长及表达的影响,旨在提高表达产量,推进其产业化进程。所得结果如下:首先探索了鱼腥藻的短期保存方法:保护剂可以增强藻细胞对4℃低温的耐受力,其中4.0%的二甲亚砜加上4.0%的甘油效果最好;接种时,藻液滴加到斜面上均匀铺开利于后一步的保存;向斜面定期补充少许无菌水以避免干燥可保存较长时间。外源质粒的转入会减慢鱼腥藻7120的生长速率:最佳的生物量收获时间与最大的TNF活性时间不同,  (本文共126页) 本文目录 | 阅读全文>>

华南理工大学
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α型人肿瘤坏死因子在鱼腥藻7120中的表达及其初步纯化

人肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种由体内激活的单核巨噬细胞产生的细胞因子。体内外试验表明其对多种肿瘤细胞株有显著的杀伤作用,尤其是局部应用TNF-α进行抗肿瘤治疗的效果明确。TNF-α是一由157个氨基酸组成的非糖基化多肽蛋白,分子量为17350Da;其生物活性形式为三聚体。目前重组TNF-α主要在大肠杆菌中克隆和表达。但是大肠杆菌的生长需要较多贵重的生化制剂;此外大肠杆菌自身含有毒蛋白,从而使大肠杆菌表达的TNF-α纯化工艺复杂化。蓝藻是一类光合自养原核生物,可作为各类生化过程研究的理想模式。由于蓝藻的生长只需阳光、二氧化碳和少数无机盐,其自身一般不含毒蛋白;加上蓝藻的大规模培养具有经济和洁净等特点,因此可将蓝藻作为大肠杆菌重组DNA产品生产的替代宿主。为探讨利用重组蓝藻进行抗肿瘤细胞因子生产的可能性,我们将人TNF-α基因转入单细胞丝状鱼腥藻7120中表达,并对表达产物进行初步的纯化。质粒PT-TNF经EcoR I和Xho...  (本文共67页) 本文目录 | 阅读全文>>

华南理工大学
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转基因鱼腥藻7120生长与外源基因表达的优化控制

α型肿瘤坏死因子(TNF—α)具有多种生物学活性,随着研究的深入,其低毒高效的的抗肿瘤作用已成为可能,在临床上具有广阔的应用前景,目前重组TNF及其衍生物的研究发展迅速。前人已成功将hTNF—α基因转入鱼腥藻7120并得到表达,为了提高细胞培养密度和外源基因表达水平,本文研究了基因工程藻的质粒稳定性及其混合营养型培养,并在反应器中研究了转基因鱼腥藻7120培养和产物TNF—α的表达,为产业化打下基础。首先研究转基因鱼腥藻生物量与吸光度的关系,得到分光光度法测定生物量的波长、测定范围和标准曲线。转基因鱼腥藻7120与野生藻生长速率很接近。影印法证实转基因鱼腥藻7120能保持质粒分配稳定性。比较无选择压力下连续传代的转基因鱼腥藻7120在不同培养基中的生长和外源基因表达,证实没有发生质粒部分缺失,但转基因鱼腥藻在无选择压力下会降低重组质粒拷贝数。在培养过程中,种子培养基含有的新霉素可以保持生产过程质粒稳定,这可以大大减少新霉素用量。...  (本文共135页) 本文目录 | 阅读全文>>

《中国科学(B辑 化学 生命科学 地学)》1989年01期
中国科学(B辑 化学 生命科学 地学)

满江红鱼腥藻单克隆抗体的制备和应用研究

满江红(俗称红萍)是一种固氮蓝藻和水生藏类共生的植物,目前公认的有6个种,分属于三膘亚属(E“。口“。)和九膘亚属(Rhi:口:p。;m。)〔1].共生于满江红叶腔中的固氮蓝藻统称为满江红鱼腥藻(A,aba。,a azollr。),属于念珠藻科鱼腥藻属(Anabaena Bory).随着满江红固氮生理及其体内鱼腥藻研究的深人,人们对不同品种(系)满江红叶腔中仅有一种鱼腥藻的说法提出异议.Gates等汇2]报道,经吸收处理的满江红鱼腥藻抗血清可以区分卡州满江红和羽叶满江红体内鱼腥藻.但Ladha等〔3,对32个不同品种(系)满江红体内鱼腥藻进行血清学试验,未发现抗原差异.唐龙飞等〔们用提纯的满江红鱼腥藻制备的抗血清可以区分两个亚属满江红的体内鱼腥藻,但它们存在较强的交叉反应.Franche等〔,,用鱼腥藻(Aob。。,。sP.Pcc 7120)的DNA探针分析三膘亚属4种满江红体内鱼腥藻的固氮酶基因,认为它们具有高度的一致性. 近...  (本文共9页) 阅读全文>>

青岛理工大学
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环境因子对伪鱼腥藻生长及光合生理的影响

水体富营养化已成为全球亟待解决的一项难题,近年来蓝藻水华的爆发是我国乃至全球水体富营养化的一个主要表现。伪鱼腥藻是我国华南地区某梯级水库群夏季敏感藻种,在此季节时有伪鱼腥藻水华发生,严重威胁本地区的供水安全。光合作用是藻类最重要的生理活动,叶绿素荧光是光合作用良好的探针,可以反应出植物受胁迫的程度。本文利用叶绿素荧光技术,探究主要环境因子氮磷浓度、pH、温度、光照对伪鱼腥藻生长及光合生理的影响,以期为伪鱼腥藻水华的预防及控制提供理论依据。试验测定的主要荧光参数有PSⅡ最大光能转化效率(F_v/F_m)、最大相对电子传递速率(rETR_(max))、光能利用效率(α)、半饱和光强(I_K)。(1)研究了氮、磷浓度对伪鱼腥藻生长、叶绿素荧光参数及类胡萝卜素与叶绿素a比值等的影响,并应用Monod方程和Droop方程考察氮、磷营养盐对伪鱼腥藻生长动力学的影响。不同氮、磷浓度对伪鱼腥藻的生长影响极显著(P0.05)。一定程度的氮磷限制下...  (本文共69页) 本文目录 | 阅读全文>>

《水资源保护》2016年03期
水资源保护

梯级水库输水线路伪鱼腥藻属时空分布特征及影响因子分析

我国可利用淡水资源有限,水库是人民生活中重要的饮用水资源。截至目前,几乎每座地表供水水库都存在一定程度的富营养化问题[1-3]。蓝藻是原核生物中最原始、最古老的藻类植物,包括单细胞和丝状体两种类型。蓝藻基于分布广、环境适应性强、能够自主调节水体垂直位置等特点使其成为多数富营养化水体中的主要藻属[4-6]。近几年蓝藻事件频发,如太湖、滇池、巢湖等湖泊及部分供水水库[7]均遭受不同程度蓝藻侵袭。目前我国对藻类研究多集中在形成“赤潮”和“水华”的微囊藻、聚球藻、多甲藻、塔玛亚历山大藻[8-13]等少量藻种上,但对于蓝藻门中伪鱼腥藻属的研究却鲜有报道。伪鱼腥藻是一种丝状蓝藻[14-15],常见于水库、鱼虾池[16-19]中,其在水体中大量繁殖会产生藻毒素、肝毒素、二甲基异次醇等代谢产物,使水体嗅味异常,产生的毒素严重威胁人类身体健康。笔者以南方某城市A、B、C3座重要的地表供水和原水调蓄串联梯级水库群为研究对象。3座水库的基本信息如下:...  (本文共6页) 阅读全文>>