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c-myc特异核酶逆转膀胱肿瘤EJ细胞恶性表型的实验研究

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c-myc基因是一种细胞癌基因,其编码产物为分子量62KD的DNA结合蛋白。c-myc基因在细胞的增殖与分化过程中起着十分重要的作用,表现在增殖旺盛的细胞中表达增强,而处在静止和分化阶段的细胞不表达或低表达。c-myc基因的异常表达是肿瘤形成的基础之一,在多种恶性肿瘤,包括膀胱肿瘤细胞中都发现c-myc的扩增和高表达。当降低细胞中c-myc基因表达水平时,可诱导细胞出现凋亡。特别是对于c-myc高表达的肿瘤细胞来说,降低c-myc的表达是致死性的。膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,也是临床上常见的肿瘤之一。对其发病机理和诊治方面的研究是泌尿肿瘤学的难点与重点。人们一直在探索肿瘤治疗的新方法,随着分子生物学的理论和技术的发展,人们在肿瘤基因治疗道路上又迈出了新的步伐。核酶(Ribozyme)技术的发现与应用为肿瘤的基因治疗研究开避了新的道路。核酶是一类具有酶活性的RNA分子,可序列特异性地与靶RNA分子结合并予切割,进而阻断靶m  (本文共88页) 本文目录 | 阅读全文>>

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肾细胞癌是泌尿外科最常见的肾脏实质恶性肿瘤,其发病率在逐年增加,严重威协着人类健康。由于肾癌细胞对化疗及放疗效果不理想。使得目前临床上除手术治疗切除癌肿外,无其它较好的后续治疗手段。基因治疗肿瘤是九十年代医学生物学领域的重大进展之一,其主要策略是阻断癌基因表达或替代、恢复抑癌基因的功能。BCL-2基因是1984年首次在滤泡性淋巴瘤细胞系中发现的,其主要通过抑制细胞的凋亡、延长细胞的寿命而参与肿瘤的发病与进展,其在肾癌组织中有较高的表达,具有不可忽视的重要性,并对肾癌细胞耐化疗及放疗亦起着重要的作用。核酶是一类具有催化活性的RNA分子,能特异性地切割RNA分子,利用核酶的这一特点,运用针对某一基因的核酶基因,将其导入并在细胞内表达,可以阻断有害基因的表达,达到治疗的目的。抗BCL-2锤头型核酶正是这样一种核酶,它可以特异性地切割BCL-2 mRNA,从而阻断BCL-2基因在癌细胞内的表达,促进癌细胞的凋亡,达到治疗的目的。本实验研...  (本文共86页) 本文目录 | 阅读全文>>

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多位点核酶抑制乙型肝炎病毒基因表达的研究

乙型肝炎其病原体是乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)。HBV是一小的DNA病毒,其复制过程需要经过RNA的生物合成阶段。HBV C基因表达的C蛋白(HBcAg、HBeAg)参与病毒核衣壳的装配,是免疫攻击的靶抗原,因此剪切C基因mRNA既可抑制HBV的复制,又可阻断HBcAg的表达。由于锤头型核酶具有分子小,可序列特异性地切割靶RNA的特点,所以可用它切割HBV C基因的RNA,阻断HBV基因的复制和表达。本研究设计多位点核酶观察其对靶RNA的切割作用。利用计算机对HBV C基因的mRNA二级结构进行分析,设计并合成了5’顺式、3’顺式核酶及针对C基因RNA的三个锤头状核酶基因,三个核酶分别剪切C基因mRNA上的不同位点。将上述核酶基因构建成带有5’和3’顺式核酶的体外转录质粒中,其中包括单个、两个或三个串联的针对靶基因的核酶基因质粒。体外转录结果表明我们构  (本文共109页) 本文目录 | 阅读全文>>

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核酶对HIV-1在人T淋巴细胞内复制的抑制效应及其影响因素

爱滋病的基因治疗需要将能有效抑制艾滋病毒复制的基因导入到HIV的靶细胞内并获得高效表达。锤头型核酶是能够催化切割与之互补的RNA分子的RNA。实验设计了两个锤头型核酶,一个针对HIV—1基因组中的tat基因(TAT—RZ),另一个针对tat基因和rev基因的共有外显子序列(TR—RZ)。通过体外转录合成的这两个核酶在体外可在生理温度下切断HIV—1基因组RNA的靶序列。将编码这两个核酶的基因克隆到逆转录病毒载体LN中。当在细胞内表达的时候,核酶作为编码细菌新霉素抗性序列的一部分而被转录,位于Neo基因编码序列起始密码子的前方。带有核酶基因的逆转录病毒载体被包裹成多受体病毒子,后者用于转化人的CEMT淋巴细胞,用RNA印迹法可很容易地检测到在被转化的CEM细胞含有核酶序列的RNA的表达。表达这两个核酶的CEM细胞对HIV—1的复制具有抑制作用,而表达突变型核酶的细胞,HIV—1的复制不受抑制。突变型核酶是在核酶的核心催化区内有一个...  (本文共99页) 本文目录 | 阅读全文>>

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抗bcl-2核酶(ribozyme)促进HL-60细胞凋亡的研究

在本实验中,我们合成锤头型RZ以切割bcl-2 mRNA,然后用逆转录病毒载体pDOR-neo把RZ基因转染入HL-60细胞,以观察RZ对HL-60细胞的致凋亡效应。通过微机对bcl-2 mRNA二级结构的分析,设计并合成针对bcl-2 mRNA的“锤头型”(hammerhead)核酶基因,平端连接于pGEM-3Zf(-)的HincⅡ位点,克隆后经测序表明序列正确,bcl-2和RZ基因经体外转录,50℃作用2h,发现RZ从第1656-1657(C-G)位之间切断了bcl-2 mRNA,表现出很强的切割活性,RZ基因经双酶切回收后,定向克隆于真核表达载体pDOR-neo的BamHI和EcoRI位点,重组的真核表达载体命名为pDOR-RZ。通过脂质体(lipofectin)介导的DNA转染法,成功地把pDOR-RZ导入HL-60细胞。HL-60细胞在含10%小牛血清的培养液中继续培养72h。用RNA斑点杂交和原位杂交的方法都已观察到...  (本文共102页) 本文目录 | 阅读全文>>

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