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水牛胚胎生殖样细胞分离培养及相关研究

1.从形态观察、碱性磷酸酶染色、表面抗原的免疫组化检测、多能性的标志基因表达和体外分化潜能等方面对水牛胚胎生殖样细胞(EG-likecells)的生物学特性进行了研究。结果发现,水牛EG样细胞形成多层结构的克隆,有明显的边界与饲养层分开,与小鼠的ES/EG克隆形态相似。通过组化染色发现,水牛EG样细胞表达AP、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4以及OCT-4。另外,RT-PCR结果显示,Fgf4除外,水牛EG样细胞均表达OCT-4、NANOG、SOX2、FOXD3、GP130、STAT3和HEB基因。将细胞延迟培养2个星期后,可以观察到成纤维样细胞,神经样细胞,肌样细胞和上皮样细胞的分化形成。悬浮培养的水牛EG样细胞可以形成简单拟胚体和复杂拟胚体(EB),复杂拟胚体仍然表达FOXD3、GP130、STAT3以及HEB基因,但已经无法检测出OCT-4、NANOG和SOX2这三个基因。此外,三个胚层标志基因的表达也在复杂拟胚体  (本文共109页) 本文目录 | 阅读全文>>

新疆农业大学
新疆农业大学

北山羊体细胞异种克隆技术的研究

北山羊属于国家一类保护动物,由于生存环境的人为破坏已濒临灭绝。为了寻找一种新的保护珍稀动物的方法,本实验对北山羊异种体细胞核移植进行了研究。先后对比了山羊卵巢运输温度,成熟液中的激素比例以及成熟时间对山羊卵母细胞成熟的影响;探讨了不同激活方法对山羊卵母细胞孤雌激活的影响;并用北山羊和山羊耳部成纤维细胞进行了建系以及核型分析和生长曲线测定;测定了不同生长状态的北山羊和山羊成纤维细胞的细胞周期;探讨了山羊新鲜卵丘细胞和培养冷冻后解冻的颗粒细胞作为核供体对山羊核移植效率的影响,电脉冲参数对重构胚发育的影响以及血清饥饿与完全汇合培养的北山羊和山羊成纤维细胞对重构胚发育的影响;并对异种重构胚进行了胚胎移植。实验得出以下结论:1、山羊卵巢运输温度以20~35℃为佳;成熟液中以FSH8μg/ml,LH0.6IU/ml成熟率较高;而随着山羊卵母细胞成熟时间延长,其成熟率提高,但去核率下降。2、电激活结合化学激活可以更好的激活山羊IVM卵母细胞;...  (本文共142页) 本文目录 | 阅读全文>>

广西大学
广西大学

转基因体细胞克隆水牛与广西水牛的遗传特性研究

首先分离培养水牛胎儿成纤维细胞,并检测细胞传代培养过程中的核型稳定性和支原体污染情况。结果发现,组织块法和胰酶消化法均可从水牛胎儿皮肤组织获得大量高活力细胞,15代以前的水牛胎儿成纤维细胞生长良好。分别对体外培养5代、15代、25代和30代的胎儿成纤维细胞染色体分析结果显示,核型的正常率随体外传代增加呈下降趋势,但各代细胞之间差异不显著(P>0.05),核型正常比率均在75%以上。设计两对PCR引物对第5、15、25和30代细胞的支原体检测污染情况进行了检测,结果检测细胞样本和阴性对照均为阴性,说明培养到30代以内的水牛胎儿成纤维细胞没有发生支原体污染。上述结果表明,在现有实验条件下水牛胎儿成纤维细胞能进行稳定传代培养,可满足体细胞核移植与转基因操作的需要。在此基础上,对影响水牛胎儿成纤维细胞在极低细胞接种密度条件下生长增殖和细胞集落形成的各种因素进行了系统的研究。结果发现,低密度接种的水牛胎儿成纤维细胞总体细胞集落形成率低于2...  (本文共127页) 本文目录 | 阅读全文>>

西北农林科技大学
西北农林科技大学

转t-PA基因牛胎儿成纤维细胞系的建立及转基因牛克隆胚的构建

本研究用奶牛β-酪蛋白基因调控序列和人组织型纤溶酶原激活剂指形区缺失体(t-PA指形区缺失体)表达序列,构建了乳腺特异性表达载体pBC1-TPA和pBC2-TPA。在这两个载体中,插入人α1-抗胰蛋白酶核基质附着区(α1-AT MAR)序列,构建成另外两个乳腺特异性表达载体pBCHM1-TPA和pBCHM2-TPA。四个载体转染小鼠乳腺上皮细胞后,发现t-PA指形区缺失体表达良好,转染pBCHM2-TPA的细胞表达效果最显著。pBCHM2-TPA转染牛胎儿成纤维细胞后,筛选稳定克隆株,通过体细胞核移植生产转基因牛克隆胚,用于研制乳腺生物反应器。相关结果如下:1.核基质附着区是一种真核生物的DNA元件,能调控染色体结构和活性。为研究体内MAR相关的染色质准入和转录调控。本研究利用PCR技术扩增人α1-AT MAR序列,全长1252 bp。序列分析表明,所克隆的片段与GenBank中登录的牛乳腺核基质附着区的同源性为99%,通过在线...  (本文共101页) 本文目录 | 阅读全文>>

《基因组学与应用生物学》2019年01期
基因组学与应用生物学

一种无血清冻存液在猪胎儿成纤维细胞上的应用研究

在猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFF)冻存过程中,血清品质常常制约着细胞的冻存效果。为了解决这个问题,本研究旨在开发一种无血清冻存液应用于猪胎儿成纤维细胞冻存。用3种不同冻存液冻存猪胎...  (本文共5页) 阅读全文>>

《现代畜牧兽医》2017年02期
现代畜牧兽医

猪胎儿成纤维细胞的质粒转染体系优化

为了探讨脂质体转染法转染猪胎儿成纤维细胞的可行性,并通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得猪胎儿成纤维细胞的最佳转染条...  (本文共3页) 阅读全文>>