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实时荧光定量PCR技术研究进展及应用

聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增DNA片段的技术,根据扩增策略和检测产物手段不同可分为定性PCR和定量PCR。定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量,而且具有灵敏度高、特异性强、准确可靠、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时性好等特点。目[19]Jimnez-Lozano E,Roy D.Effective sorbents for solid-phaseextraction in the analysis of quinolones in animal tissues bycapillary electrophoresis[J].Electrophore...  (本文共8页) 阅读全文>>

河南农业大学
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猪伪狂犬病毒、细小病毒和圆环病毒2型多重SYBR Green Ⅰ实时PCR检测方法的建立

猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus, PRV)、猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)是引起母猪繁殖障碍的3种主要病原体;猪伪狂犬病毒可引起家畜以及多种野生动物发热、奇痒和急性脑脊髓炎等神经症状,妊娠母猪流产、产死胎或木乃伊胎;猪细小病毒感染可引起母猪流产、不孕,胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化等,同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻;猪圆环病毒2型可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS),母猪繁殖障碍,皮炎及肾病综合征、肠炎等。目前,针对以上3种病毒病的诊断方法有很多,这些方法具有操作复杂、费时费力、敏感度差及阴性率高等缺点;临床已经使用的PCR诊断技术,虽然有灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点,但不能准确定量...  (本文共114页) 本文目录 | 阅读全文>>

河南农业大学
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猪伪狂犬病病毒PCR诊断方法的建立

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,常常引起母猪流产、死胎;成年猪则系隐性感染,长期带毒排毒,严重影响种猪场生产及优良品种的推广,给养猪业造成极大的损失。疫苗免疫接种和疾病的早期鉴别诊断是有效防制和根除伪狂犬病的根本措施。传统的病毒分离、血清学方法等检测技术在猪伪狂犬病防制中发挥了重要作用,但这些方法存在费时、费力、操作繁琐、敏感性不高或特异性不强、不能检出潜伏感染和对病毒进行定量检测等缺点。因此,探求新的PRV检测技术是伪狂犬病防制研究的主要内容之一。gH基因是伪狂犬病病毒中较保守和病毒复制所必需的基因;gE基因是伪狂犬病病毒的毒力基因也是多种基因缺失疫苗的缺失基因。本研究设计并合成了PRV的gH和gE基因序列的2对引物,分别建立了gH、gE的单一PCR检测方法,并用琼脂糖电泳鉴定PCR产物,回收PCR产物测序,与预期的结果完全相符,证实了该扩增片段的特异性,并对PPV...  (本文共72页) 本文目录 | 阅读全文>>

河南科技学院
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RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测CSISV在SPF雏鸡体内分布

鸡生长与免疫抑制综合征病(暂命名,Chicken Stunt and Immunosuppression Syndrome Virus)是造成家禽生长和免疫抑制的重要传染性病之一。本课题在前期研究的基础上,应用RT-PCR和TaqMan荧光定量RT-PCR方法,对SPF雏鸡人工感染后病毒在鸡体内的分布进行了研究,旨在找到病毒的亲嗜器官和在鸡体内的生长规律。根据CSISV全基因序列设计出了一对大小为540bp引物F1/F2、一对大小为117bp引物F3/F4及一条特异性探针。运用已建立的RT-PCR方法研究7日龄SPF雏鸡人工感染CSISV-ZZ2004毒株后病毒在鸡体内的分布和排毒情况。结果表明,病毒感染后在SPF雏鸡所有15个器官中均检测到了病毒,感染后最先于第9h在肺脏、气管和直肠中检测到病毒核酸,最晚于第120h在心脏中检测到病毒核酸;408h后所有组织均呈病毒核酸阴性。感染后能检测到病毒核酸阳性持续时间最长的是胰腺(38...  (本文共110页) 本文目录 | 阅读全文>>

福建农林大学
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PCR检测螺类感染广州管圆线虫方法的研究

随着人们生活水平的提高、交通日益便捷及饮食习惯的改变,使得我国近几年来食源性疾病的病例增长迅猛,人兽共患的疾病种类也日益增多,广州管圆线虫病便是其中之一。自20世纪90年代以来我国先后在北京、温州、云南和福州等地发生多起广州管圆线虫病小范围的暴发流行,其中又以2006年夏秋季北京病例多达200多例为甚,引起市民的恐惧和相关方面的高度重视。本文综合介绍了广州管圆线虫病的研究现状、中间宿主的种类及其诊断技术的研究现状。针对目前广州管圆线虫感染的中间宿主螺类的特点,本研究鉴定了来自广州、广西及上海等地的管圆线虫并建立了针对广州管圆线虫的PCR、实时荧光PCR的特异性检测方法,其具有检测时间短、灵敏度高,特异性强等特点,并对几种杀灭福寿螺的药物进行了实验室初步研究。本文为贝类鲜活产品等体内的广州管圆线虫检测及野外带疫普查提供了良好的诊断方法,对食品安全、预防和控制广州管圆线虫病暴发和流行具有重要的意义。研究结果如下:1.虫种鉴定:本试验...  (本文共80页) 本文目录 | 阅读全文>>

南京农业大学
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三种植物病原细菌的实时荧光定量PCR检测

萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种(Curtobacterium flaccumfaciens pv. Beticola, cfb)是引起糖甜菜(Beta vulgaris var. saccharifera)叶斑病的主要病原物。依据该病原菌的16S-23S rRNA ITS区(登陆号为AY191513)在特异性位点用Primer Premier 5.0设计了一对引物CfbF(5′-TCAGTGCTGGTCGCCCATTAG-3′)和CfbR(5′-AACAACGTGCACCAGCCAGC A-3′),预计PCR扩增产物为191 bp。用该引物扩增3个cfb菌株及29个参比菌株,仅靶标菌扩增出191 bp产物;在实时荧光定量PCR检测体系中,靶标菌株都检测到较强的信号,熔解曲线为单峰,没有非特异性扩增。为建立标准曲线将靶标基因组DNA稀释为0.001 ng,0.01 ng,0.1 ng,1 ng,10 ng共5个梯度,进行实时荧光PCR...  (本文共57页) 本文目录 | 阅读全文>>