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RNA干涉技术

在后基因组时代,仅有基因序列是远远不够的,对基因功能的研究在以其前所未有的速度发展着;与此相应,各种研究基因功能的新技术也不断涌现。作为一种新的、强有力的研究工具,RNA干涉(RNAinterference,RNAi)在功能基因组学研究中的巨大应用潜力,使得该技术成为当今最引人关注的话题之一眼1,2演。2001年,RNAi技术被Science评为最重要的成果之一。1RNAi的发现RNA干涉的现象大致有3种,它们的作用机制大体相同,只是不同的研究者对RNAi有不同的命名:植物学家称之为协同抑制(cosuppression);菌类学家称之为静息作用(quelling);昆虫学家和动物学家称之为RNA干涉眼3演。1990年,Jorgensen及其同事在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现眼4熏5演:他们将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮牵牛中,试图加深花朵的紫色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了...  (本文共4页) 阅读全文>>

黑龙江八一农垦大学
黑龙江八一农垦大学

RNA干涉技术在烟草抗TMV病毒育种中的应用

烟草病毒病是世界各烟草产区普遍发生的一类主要病害,也是其它农作物的主要侵染毒源,其种类多,危害严重。生产中常以选用抗病品种作为主要防治手段,但抗病品种存在抗性单一、抗性资源狭窄等局限,不能持久、有效地控制病毒危害。RNA干涉技术为病毒病害的防治开拓了一条新机制。本试验依据RNAi机制,以TMV复制酶基因部分序列为靶序列,经反向重复连接构建到含35S超强启动子的表达载体,转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌LBA4404中,完成植物双元表达载体系统构建。经叶盘法转化获得11株转基因烟草苗。经人工接毒验证,其中7株对TMV具有免疫级抗性。初步证实了RNAi在增强植物抵抗病毒能力方面的显著效果。试验主要内容包括:1.目的基因靶序列的克隆首先对TMV 5种分离株复制酶基因序列进行BlastP序列比对,寻找保守序列,确定进行RNAi的靶序列,设计靶序列引物TMV-r1/TMV-r2。从黑龙江省烟草研究所试验场采集感染普通花叶病的烟草幼嫩叶片,提...  (本文共74页) 本文目录 | 阅读全文>>

中国人民解放军军事医学科学院
中国人民解放军军事医学科学院

RNA干涉技术平台的建立及肝癌侵袭转移相关基因RNA干涉研究

肝癌是常见的恶性肿瘤之一,世界上每年约有100万例病人死亡,其发病率与病死率之比高达1:0.98。肝癌的病死率如此之高,根本原因之一是其高侵袭转移性所致。肝癌的侵袭转移是一个多步骤,有多因素参与的极其复杂的过程。本文以RNA干涉为主要手段,试图将肝癌侵袭转移不同步骤中的相关基因(HPO、c-met和MT1-MMP基因)沉默,从而为建立抑制肝癌侵袭转移的细胞模型和体内外抑癌效应机理及基因治疗的研究奠定基础。在本研究中,首先建立了一套基于载体策略的RNA干涉实验技术平台。H1启动子为Ⅲ型的RNA聚合酶Ⅲ(Pol Ⅲ)启动子,由于可在人类细胞中高水平地表达目的RNA分子,以及其所有的顺式作用元件皆位于待转录物的5′外侧区域,因此非常适于RNA干涉载体的构建。利用全长374bp的H1启动子序列构建了四种RNA干涉载体:pSL、带有绿色荧光蛋白(EGFP)标签的pESL、pcDDH和pRDH。就干涉载体pSL和pESL而言,以RNA干涉p...  (本文共94页) 本文目录 | 阅读全文>>

华中农业大学
华中农业大学

芥菜型油菜多室基因Bjmc1启动子与RNA干涉分析

油菜多室性状是已被证明的产量性状,有利于油菜高产。Bjmc1基因是芥菜型油菜多室基因,其两室基因BjMc1突变后导致油菜角果形成三个腔室,每角果粒数增加,单株产量增大。本研究通过BjMc1基因启动子生物信息学分析和启动子截短表达分析找到基因核心启动子区段,为后续寻找相关转录因子及多室角果形成过程的调控途经研究提供基础;本研究还通过RNA干扰BjMc1基因的表达,进一步验证多室基因在油菜角果发育过程中的功能。主要研究结果如下:1.BjMc1启动子生物信息学分析用PlantCARE数据库在线分析BjMc1基因上游启动子序列发现,该段包含有光响应元件、逆境胁迫响应元件、激素响应元件、CGTCA-motif茉莉酸甲酯响应元件、MYB转录因子结合位点、ELI-box3诱导子响应元件、CAT-box分生组织表达响应元件、5UTR Py-rich stretch高效转录相关元件等。2.BjMc1启动子核心区段的发现分两次构建了8个BjMc1启...  (本文共68页) 本文目录 | 阅读全文>>

中国农业科学院
中国农业科学院

利用T-DNA插入突变和RNA干涉技术研究水稻基因功能

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一,同时也是单子叶植物和禾谷类作物分子生物学研究的模式植物。目前水稻基因组序列测定工作已经基本完成,预测的编码基因超过40,000个。已测定的水稻全长cDNA克隆数目也已经超过32,000个。确定这些基因的功能将是今后研究的中心任务。鉴于根癌农杆菌介导的水稻遗传转化方法近年来日趋成熟,利用转基因的方法获得突变体被认为是水稻功能基因组学研究的主要途径之一。本研究利用T-DNA插入突变和RNA干涉技术创制水稻突变体,并根据突变体的表型来研究相应基因的功能和表达模式。本研究是中国高技术研究发展计划项目“水稻突变体库的创制与功能基因组学研究”和国家自然科学基金项目“水稻受体激酶功能及其与环境信号分子的作用”的一部分,通过与合作者的共同努力,取得了以下主要研究进展:建立了一套高效快速的根癌农杆菌介导的水稻遗传转化程序,从诱导成熟胚来源的愈伤组织开始,约90d后即可得到转化植株...  (本文共85页) 本文目录 | 阅读全文>>

中国农业科学院
中国农业科学院

水稻功能候选基因RNA干涉载体的构建及其应用

RNA干涉(RNA interference,RNAi)技术是通过双链RNA的介导特异性地降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默。该技术已被广泛应用于植物基因功能研究。与其他技术相比,RNA干涉技术具有特异性强、沉默效率高等优点。本文应用Gateway技术进行水稻功能候选基因RNA干涉表达载体的构建,并进行遗传转化研究。Gateway技术是通过多重载体,高效构建目标基因及任何DNA片段克隆载体和表达载体。该技术以λ噬菌体的位点特异性重组体系为基础,两端具有位点的DNA片段或目标基因可以非常容易地被重组克隆到含同源重组位点的载体上。本文采用Gateway技术体系,以水稻细胞程序性死亡相关功能候选基因OsCDC5、OsDAD1、OsPDCD5为目的基因,从中选取目标区段进行RNA干涉表达载体的构建,经过attB-PCR扩增、BP反应、LR反应后,成功构建了三个水稻功能候选基因的RNA干涉双元表达载体,为大规模构建水稻功...  (本文共65页) 本文目录 | 阅读全文>>