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实时荧光定量检测HCV RNA含量的临床意义

O引言 丙型且}炎病毒(hepa:1 t 1 5 C virus,HCV)属黄 病毒家族的正链RNA病毒,是引起输血后肝炎的主 要病原之一,常呈无症状的持续感染,约60%的感 染者会演变成肝硬化和肝癌,而且与肝脏脂肪变、 糖代谢紊乱有关之‘一’7 .HCV抗体检测已不能用来作 为评价疾病预后和判断抗病毒治疗效果的指标,而 病毒含量能真实反映其在体内的复制情况,高滴度 病毒含量患者对治疗的反应不敏感,而且疗程也较 长·1吕’9,}大1此对血清中HCV RNA进行定量就显得 十分重要,将有助于判断疾病预后,选择治疗方案 及监测治疗效果等.我们利用荧光共振能量转移 (f’1 uoreseenee resonanee energy transfer, FRE劝原理,在HCV基因组5’非编码区(5’UTR) 区设计特异的引物和一对杂交探针,建立了实时荧 光定量(,,eal一time fluorescenee quantita- tiveR...  (本文共5页) 阅读全文>>

《中国热带医学》2007年08期
中国热带医学

双探针实时荧光定量法检测HCV RNA抗原的临床意义

丙型肝炎病毒是引起输血后肝炎的重要病原之一,常呈无症状的持续感染,约65%的患者会发生肝硬化和肝癌[1]。丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV RNA)实时荧光定量(RFQ-RT-PCR)检测对丙型肝炎的诊断、治疗和预后观察具有重要价值。然而随着这一方法的广泛应用,其灵敏度和特异性受到不少质疑,甚至出现抗HCV阳性,HCVRNA荧光定量阴性的报道[2]。因此,有必要建立双探针荧光定量HCVRNA检测方法,以提高检测的灵敏度和特异性。1对象和方法1.1对象选自肝炎病科门诊患者100例,用ELISA测得抗HCV阳性,其中慢性肝炎45例、肝硬化30例和肝癌25例);另选取输血科抗HCV阴性献血员100例。1.2方法1.2.1引物和探针设计根据HCV全序列[2](GenBank注册号为AB114136),在HCV基因组5’非编码区(5’-UTR),应用Primer5.0软件,设计如下引物和探针:HCV-S:5’-AACTACTGTCTTCACG...  (本文共2页) 阅读全文>>

《临床检验杂志》2005年05期
临床检验杂志

实时荧光定量RT-PCR内参基因的选择

实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescent quantitativereverse transcription-polymerase chain reaction,FQ RT-PCR)是检测低丰度mRNA的敏感方法,为了去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异,通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。内参基因扩增中的变化可以反映RNA产量、质量和/或cDNA合成效率的变化。选择适当的内参基因以减少检测标本间的差异是必须的。本文就FQ RT-PCR内参基因的选择作一简要综述。1内参基因应具备的条件理想的内参基因应该满足以下条件:①不存在假基因(pseudogene),以避免基因组DNA的扩增;②高度或中度表达,排除太高或低表达;③稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞),而且其表达量是近似的,无显著性差别;④表达水平与细胞周期以及细胞是否...  (本文共3页) 阅读全文>>

《激光生物学报》2005年06期
激光生物学报

实时荧光定量PCR的应用和进展

实时荧光定量PCR(Real-time Flurescent Quanti-tive Po1ymerase Chain Reaction)是将荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer,FRET)应用于常规多聚酶链式反应(Po1ymerase chain reac-tion,PCR)仪中,通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用,能量从供体发色团转移到受体发色团,受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比,检测PCR过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度,从而达到定量目的。实时荧光定量PCR技术于1995年由美国PE公司推出后,Heid[1]等首先就其原理及方法进行了报道。由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已在动植物基因工程,微生物和医学领域中得到广泛应用[2]。1实时定量PCR...  (本文共6页) 阅读全文>>

《重庆医学》2005年03期
重庆医学

实时荧光定量PCR标准品的制备及应用

近几年来,实时荧光定量 PCR技术因高精确度、高灵敏性、污染少等优点已在临床医学及生物医学基础科研中得到广泛应用。它是在每个循环后都对扩增产物进行检测,其灵敏度比传统PCR高出2~3 个数量级,且能通过 CT值较好的反映目的DNA初始模板量。随着实时荧光定量 PCR的逐步大量应用,我们也需要能更加精确反映目的DNA的标准品。1 材料与方法1.1 实验材料与仪器 A549 细胞(由本室保存),1640 培养基(Gibico公司), 小牛血清(兰州民海生物),Tripure(Roch公司), 逆转录试剂(Promega 公司), PCR试剂(宝生物公司),胶回收试剂盒(Omega公司),大量质粒抽提试剂盒(Omega公司),pMD18 T vector 连接试剂盒(宝生物公司),感受态菌JM109(本室保存),氨苄青霉素 50mg/ml,LB培养基,按《分子克隆》配,TAQMAN 探针由上海基康公司合成, X gel, IPTG(S...  (本文共2页) 阅读全文>>

《生态学报》2005年06期
生态学报

实时荧光定量PCR及其在微生物生态学中的应用

量化微生物群落的组成,确定群落的优势类群[1,2]或具有某种生物学功能微生物类群[3]的丰度,在微生物生态学的许多研究领域中都是非常必要的。然而许多环境微生物是不可培养的,这给人们的研究带来了一些障碍。最近包括PCR在内的许多分子生物学方法,提供了不依赖于培养的新技术,使人们对环境微生物群落组成和丰度有了进一步了解。实时荧光定量PCR技术作为一种核酸定量的手段,以其高灵敏性、高特异性、高精确度、实时性、污染少等优点,在微生物生态学中逐渐得到广泛的应用。与其他的分子生物学技术[4~6]的联合应用,使我们不仅可以定性,也可以定量研究微生物群落结构组成及数量变化,深入探索微生物群落与环境因子之间的相互作用及其动态变化过程。1实时荧光定量PCR技术概述1.1实时荧光定量PCR技术的发展PCR技术发明以来,研究人员一直致力于用其进行核酸精确定量。1991年Holland等[7]首次运用不可延伸的寡核苷酸杂交探针与模板结合,然后利用DNA聚...  (本文共6页) 阅读全文>>

《中国现代教育装备》2018年21期
中国现代教育装备

实时荧光定量PCR技术的原理及其应用

聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。它具有许多优点:特异性、易重复、高效性等,可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验,因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。但是,传统PCR技术有它的缺点,它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量,同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究,直到1996年由美国AppliedBiosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase ChainReaction,FQ-PCR;real-time quantitative PCR, RT-q PCR or qPCR),它是通过荧光染料或荧光标...  (本文共3页) 阅读全文>>