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大肠杆菌L-天门冬酰胺酶Ⅱ基因的高效表达

大肠杆菌L-天门冬酰胺酶Ⅱ基因的高效表达刘景晶,李晶,吴梧桐,胡梅清(中国药科大学生物化学教研室,南京210009;南京铁道医学院生物化学教研室,南京210009)摘要用一对与大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ基因(AnsB)两侧序列互补的寡核苷酸E1,E2作引物,以大肠杆菌野生株CPU210009的染色体DNA为模板,通过PCR扩增得到约1.2kb的DNA片段,将此片段插入pKK233-2的tac启动子下游,转化不同的大肠杆菌宿主菌株,结果表明以CPU210009为宿主菌时,转化子的酶表达量最高,重组L-天门冬酰胺酶占菌体总蛋白48.3%,发酵液酶活力达400IU/ml;比活为48IU/mg蛋白,SDS-PAGE显示纯化后的重组L-天门冬酰胺酶分子量与天然酶相同,均为140KD。关键词大肠杆菌;L-天门冬酰胺酶Ⅱ;基因表达L-天门冬酰胺酶Ⅱ(AnsB)能催化天门冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨。淋巴瘤和白血病细胞通常不能合成天门冬酰胺,L-天门...  (本文共5页) 阅读全文>>

《中国实验方剂学杂志》2012年23期
中国实验方剂学杂志

江苏产不同采收期明党参中L-天门冬酰胺的动态累积变化

明党参是我国特有的伞形科明党参属的单种属植物,为我国著名的特产药材之一,江苏特产道地药材之一,具有补气生津,润肺化痰,平肝和胃,消肿解毒之功效。本课题组[1-4]首次从明党参根的水溶液中分离得L-天门冬酰胺,并经药理实验证实其对氨水雾化刺激引起的小鼠咳嗽有显著的抑制作用,能显著抑制乙酰胆碱和组胺引起的豚鼠哮喘,具有明显的镇咳、平喘、祛痰作用[1-3]。并以其为指标成分优选了止咳祛痰宁参胶囊的制备工艺[3]。近年来,有学者运用HPLC和比色法分析了明党参植株内不同部位的多糖、甘露醇、胆碱、生理性灰分和水溶性成分显示茎叶与根中胆碱、多糖、水溶性浸出物和生理性灰分含量均差异显著。其多糖累积呈现2个明显的拐点,最高含量在6月份左右,最低含量在12月份左右[5-7]。关于明党参主要中医功效水溶性成分L-天门冬酰胺动态积累变化尚未见报道。本文采用OPA柱前衍生HPLC逐月测定江苏产明党参中的L-天门冬酰胺含量,绘制了动态累积变化曲线,为栽培...  (本文共4页) 阅读全文>>

《百泉农专学报》1978年01期
百泉农专学报

水稻中期营养诊断

一、原 理 在水稻开始穗分化前后缺乏氮素时,除穗以外,其它器官中都不存在天门冬缴胺。在氮。素供应充分时,水稻体中经常存在天门冬酞胺,如果其间氮素供应受到限制,则天门冬酞胺也随之消失。因此,天门冬酞胺与水稻的氮素营养状况有密切的关系,可以把灭门冬酞胺看成是氮索过剩的产物才狼猖这种见解,在水稻上检出天门冬酞胺时,可以断定 氮。如果。检不出天门冬酞胺则可断定为缺氮。 二、方 法 天门冬既胺用纸上层析法很容易检出。 于水稻出穗前20—一28天,在主茎的未展开锥状叶的绿色部分剪取5—一7厘米,共剪5—一7枚,用钳子榨汁。用乙烯树脂毛细管(宜径1毫米)吸取榨出液,滴在剪好的定量滤纸的园圈位置(见附图),至汁液扩散到直径为0.5—一0.7厘米的园形为止。干了之后再反.复操作几次。为了保持滤纸洁净,用...  (本文共2页) 阅读全文>>

《分析化学》2003年10期
分析化学

固定化L-天门冬酰胺酶活性的X射线微区分析

1 引  言固定化L 天门冬酰胺酶的研究长期以来倍受人们的关注。共价法是一种常用的方法 ,该方法通过载体与酶之间形成共价键而将酶固定于载体上 ,这样可防止酶的脱落 ,故而起到了催化作用。对固定化L 天门冬酰胺酶进行活性定位的研究 ,将有助于L 天门冬酰胺酶的固定化 ,其活性定位的基本原理如下 :底物 酶 产物 +捕捉剂 (金属离子 )活性部位沉淀利用聚焦电子束对固定化酶表面进行激发 ,有活性的部位发射出沉淀金属的特征X 射线 ,利用X 射线能谱分析即可定位酶的活性部位。本文利用MgCl2 作为捕捉剂 ,以L 天门冬酰胺为底物 ,经固定化L 天门冬酰胺酶与其作用得到氨 ,氨与镁及磷酸根作用生成磷酸氨镁的白色沉淀而沉积于活性部位。利用X 射线微区分析对固定于聚合物载体上的L 天门冬酰胺酶进行了活性定位 ,找到了最佳定位条件 .并对不同结构载体固定化酶活性进行了研究。2 实验部分2 .1 仪器及材料 KYKY 10 0 0B扫描电镜 ...  (本文共1页) 阅读全文>>

《国外医学(寄生虫病分册)》1993年05期
国外医学(寄生虫病分册)

恶性疟:丛生状天门冬酰胺富含蛋白与福氏佐剂或免疫刺激复合物在实验兔中所引起的免疫作用

恶性疟原虫丛生状天门冬酞胺富含蛋白《CARP)为一约含30形天门冬酞胺的裂殖子相关抗原。恶性疟原虫基因组中所克隆的1.4kbOARP基因5’端DNA序列的分析提示该基因片段可能编码完整的CARP,且该基因产物是分子量为50kDa的蛋白质。为分析OARP的免疫原性,本实验采用了pRIT31CARP质粒于E.coli IM103中表达葡萄球菌蛋白A刀ARP融合蛋白(SpA一OARP),以及用PRITZsNBIB:CARP质粒于E.eoliRRILM巧中表达链球菌蛋白G血清白蛋白连接域一CARP融合蛋白(BB一OARP),超声处理后得菌体蛋白,并分别经人I沙一琼脂糖凝胶或人血清白蛋白一琼脂糖凝胶亲和层析纯化。分别以(1)SpA一 CARP一卜福氏完全佐剂(FOA)和(2)SpA一CARP十免疫刺激复合物(ISCOMs)对两组新西兰白兔肌注免疫,4周后以类似方式加强免疫,18周后用SpA-CARP+PBS或BB一CARP+PBS再次加强...  (本文共2页) 阅读全文>>

《中国药科大学学报》1960年20期
中国药科大学学报

大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ的基因克隆与表达

大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ的基因克隆与表达李晶,刘景晶,吴梧桐等.药物生物技术,1995,2(4):8用一对与大肠杆菌编码L-天门冬酰胺酶Ⅱ(L-ASPsⅡ)的基因ansB两侧序列互补的寡核苷酸L1、L2作引物,以L-ASPsⅡ的野生型生产菌CPU210009染色体为模板,经PCR扩增得到长约1.6Kb的DNA片段。该片段通过以LP1、LP2为内引物的PCR反应,证明包含了ansB基因的编码序列。将此片段经xbaⅠ、HindⅡ消化,插入质粒PUC18、PUC19上构建重组质粒PUA1...  (本文共1页) 阅读全文>>