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高产纳豆激酶菌株的筛选及其酶学稳定性的研究

纳豆激酶是一种具有潜力的溶栓药物。它能够有效减缓血栓的形成,且溶栓作用明显高于同等剂量的尿激酶,同时它也能够通过蛋白水解作用直接溶解纤维蛋白凝块。本论文从贵州本土特色食品中分离筛选出的高产纳豆激酶的菌株,通过对其进行综合性能评价,包括安全性能、益生性能和发酵性能的评价。在此基础上采用主成分析,找到综合性能最好的一株高产纳豆激酶菌株。通过丙酮沉淀法和反胶束萃取法相结合对粗酶液进行纯化得到电泳纯的纳豆激酶,最后采用多种化学修饰相结合的方法对纳豆激酶进行酶学改造,并研究其酶学稳定性。首先本实验采用酪蛋白平板法和琼脂糖—纤维蛋白原平板法从贵州本土特色食品的样品中分离出能水解酪蛋白的菌株,并得到78株菌产纳豆激酶的菌株。通过对15株高产纳豆激酶菌株的菌落形态和菌体形态观察,初步判断15株高产纳豆激酶菌株均为芽孢杆菌属(Bacillus)。最后通过紫外分光光度法对筛选得到的15株高产菌株进行纳豆激酶酶活力精确测定。测得菌株GUJN05产酶能  (本文共99页) 本文目录 | 阅读全文>>

华中农业大学
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高产纳豆激酶菌株的筛选及其酶学性质的研究

纳豆激酶(Nattokinase,NK)是日本传统发酵食品纳豆在发酵过程中由纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)产生的一种有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶。研究表明,NK具有很强的溶解血栓功能,与目前临床所用的尿激酶、链激酶等溶栓药物相比,NK具有安全性好,易被人体吸收,作用直接迅速,药效持续时间长,可由纳豆枯草芽孢杆菌直接发酵生产因而造价低廉等优点。因此许多学者预言,NK将是一种很有潜力的新型溶栓药物。本论文通过对原始菌株进行紫外诱变、纤维蛋白平板初筛、摇瓶发酵复筛的方法筛选出一株高产NK的纳豆枯草芽孢杆菌BSN-3菌株,并对BSN-3菌株所产NK的分离纯化及理化性质等展开了系列研究。通过计算紫外照射芽孢的致死率,确定诱变时间为4min。通过纤维蛋白平板筛选和酪蛋白平板筛选结果的比较,发现酪蛋白平板筛选结果并不可靠。通过单因素实验和正交实验研究了液体发酵产NK的最佳条件。结果表明优化培养基组成为:胰蛋白胨...  (本文共64页) 本文目录 | 阅读全文>>

辽宁大学
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纳豆激酶热稳定性的突变及其在基因工程菌中的表达

在发酵纳豆类食物的过程中,纳豆发酵菌能够生产出一种碱性丝氨酸蛋白酶,即纳豆激酶(Nattokinase,NK)。纳豆激酶能够有效的溶解纤维蛋白(人体内血栓的主要成分),其作为一种新型溶栓类药物或者保健食品,与同类尿激酶等产品相比具有着生产原料价格低廉、安全性高等优势,具有广阔的市场前景。在纳豆激酶工业生产过程中,由于蛋白质分子的结构的破坏会出现热损耗高、酶活性低等现象。通过分子生物学手段,对纳豆激酶进行改造以提高其热稳定性和酶活性,以获得适应纳豆激酶大规模工业化生产的基因工程菌。本实验选择使用pET-26b原核表达载体,分别构建了含有纳豆激酶成熟肽、前导肽+成熟肽的原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌BL21中。在经过IPTG诱导表达后,离心收集菌体,超声破碎菌体,SDS-PAGE检测蛋白表达。纤维蛋白板法检测表达蛋白的酶活。结果显示,纳豆激酶成熟肽及前导肽+成熟肽在大肠杆菌中均可成功表达;成熟肽表达的上清液和沉淀,均未表现出纤溶...  (本文共67页) 本文目录 | 阅读全文>>

江南大学
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纳豆激酶热稳定性及pH稳定性的改造研究

血栓类疾病已严重影响到人类的健康,因此新型溶栓药物的开发成为非常重要的研究领域。纳豆激酶是纳豆在发酵过程中产生的具有很强溶栓活性的碱性丝氨酸蛋白酶。由于无免疫原性、可口服、成本低等优点,纳豆激酶被认为是最具潜力的新型溶栓药物。然而野生型纳豆激酶的稳定性较差,严重限制了其生产和应用。为了克服天然纳豆激酶性质的缺陷,本文综合利用理性设计与半理性设计的策略对纳豆激酶的稳定性进行功能进化。首先通过定点突变提高了纳豆激酶的热稳定性和酸性稳定性;之后采用组合突变进一步提高了纳豆激酶的综合稳定性;并以计算机分子动力学模拟为基础,寻找到酶分子中的酸敏感区域,通过对其筛选改造,研究分析氨基酸位点或氨基酸种类对酸性稳定性的影响,获得纳豆激酶分子结构与酸性稳定性之间的相关信息。主要研究结果包括:(1)将位于纳豆激酶分子表面的天冬酰胺和谷氨酰胺分别突变为天冬氨酸和谷氨酸,成功提高了纳豆激酶的酶活和热稳定性。其中,Q59E的酶活提高为野生型酶(WT)的1...  (本文共54页) 本文目录 | 阅读全文>>

辽宁大学
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纳豆激酶体内药效和毒性研究

纳豆激酶(nattokinase,NK)是由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis natto),在纳豆发酵过程中产生的一种具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶。研究表明纳豆激酶不仅易于提取纯化,成本低廉,溶栓效果好,药效时间长,而且安全性好,为解决目前抗血栓类药物的口服性差,价格昂贵、并发症多等问题带来更多希望。本文通过应用实验室分离到的高产纳豆激酶菌株(Bacillus subtilis natto LNUB236)经过发酵培养,以发酵液为原料,采用硫酸铵沉淀纳豆激酶,将离心后的沉淀用磷酸盐缓冲液溶解,得到的纳豆激酶粗酶液,进行两次Sephadex G-75凝胶层析,收集到的纳豆激酶活性组分经过冷冻干燥得到冻干粉,并定量将冻干粉装入大鼠专用肠溶胶囊,以口服纳豆激酶肠溶胶囊的给药方式来评价纳豆激酶在体内的药效作用、体内急性毒性和长期毒性,为纳豆激酶的临床应用和产品开发提供相应的理论基础。纳豆激酶抗血栓的作用评价是通过构建S...  (本文共66页) 本文目录 | 阅读全文>>

辽宁大学
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枯草芽孢杆菌LNUB236的纳豆激酶表达及定点突变修饰热稳定性的研究

纳豆作为一种传统食物,在日本被食用已有上千年的历史。纳豆激酶(Nattokinase,简称NK)是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisnatto)产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶。研究表明,NK具有很强的溶解血栓能力,具有安全性好,作用迅速,可口服,易被人体吸收,药效持续时间长,易获取等优点。因此,NK作为一种新型的溶解血栓药物具有很大的研发前景。本研究通过PCR技术分别扩增包括枯草芽孢杆菌LNUB236的纳豆激酶成熟肽、前导肽与成熟肽、全长的纳豆激酶酶原基因,构建pET-26b原核表达载体和pGAPZαA真核表达载体,转化到大肠杆菌BL21菌株和毕氏酵母X-33菌株中诱导表达,并运用SDS-PAGE技术分析表达结果。利用纤维蛋白平板法对表达产物进行纤溶活性大小的测定。通过FoldX软件应用生物信息学方法对纳豆激酶热稳定性相关氨基酸进行分析预测,并利用重叠延伸PCR方法对预测的103-Gln、226-...  (本文共58页) 本文目录 | 阅读全文>>

华中农业大学
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肠溶性纳豆激酶胶囊及降血糖大豆功能食品研制

纳豆激酶和1-脱氧野尻霉素(DNJ)分别在治疗糖尿病和血栓上有良好的疗效。然而纳豆激酶本身耐酸能力差,暴露在在胃酸环境中1h就会完全失活,这严重影响其口服效果。本研究采用胶囊化的方式提高了纳豆激酶的抗酸能力,从而部分解决纳豆激酶遇胃酸失活的问题。液体发酵生产DNJ能力有限,并且DNJ的提取工艺较为复杂,这严重制约了 DNJ的生产和应用。本研究以固体发酵的方法制作出含有DNJ的发酵食品,有望解决因提纯DNJ而过多投入生产成本的问题。首先,本研究以聚谷氨酸、海藻酸钠为主要壁材,制作纳豆激酶胶囊,并从包埋率、耐酸性以及模拟人体肠胃条件控制释放等方面对胶囊品质进行评价。通过单因素实验对胶囊工艺进行优化,纳豆激酶胶囊优化后配方是:聚谷氨酸浓度4%,海藻酸钠浓度3%,乙醇浓度80%,氯化钙浓度4%。用该方式制得胶囊的包埋率为64.84%。此胶囊能有效的保证40%以上的纳豆激酶在低pH的条件下维持其生物活性,在体外模拟人体肠道环境中能缓慢释放...  (本文共69页) 本文目录 | 阅读全文>>