分享到:

产肠毒素性大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的克隆与原核表达

本论文利用载体呈现技术和重叠延伸反应(PCR)构建K88ac-STII融合基因,并在pET–28a原核表达载体中进行表达。根据K88ac结构基因设计一对引物,并使引物两端含有Nco I 和XhoI限制性内切酶位点。通过PCR技术获得K88ac结构基因846bp,用限制性内切酶BsaJI将846bp的片段酶切为536bp和310bp的两个小片段,采用重叠延伸PCR技术,将STII的部分结构基因嵌入K88ac结构基因高度可变区域,克隆于载体pBS-T,得到阳性克隆,经过序列测序,表明已成功构建了K88ac-STII融合基因,命名为T-K88ac-STII。用NcoI和XhoI限制性内切酶分别酶切重组质粒和表达载体pET-28a,分别回收894bp和5.2Kb片段,用T4 DNA连接酶将回收片段连接,构建原核表达重组质粒pET-K88ac-STII,将此重组质粒转化到DH10B,菌落PCR鉴定后,进行大量培养,提取重组质粒pET-K8  (本文共52页) 本文目录 | 阅读全文>>

《西北农业学报》2009年03期
西北农业学报

产肠毒素大肠杆菌K88ac-STⅡ-LTA2/LTB融合基因在苜蓿中的表达

新生仔猪大肠埃希氏菌性腹泻(colibacillusdiarrhea of newborn piglet)是由产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenicE.coli,ETEC)引起的以1-7日龄仔猪下痢为特征的一种急性致死性多发性传染病[1]。目前,该病的防治以药物和疫苗为主,但药物价格昂贵,且耐药菌株日益增多,因此免疫预防是控制该病的最佳选择。近年来,随着粘膜免疫理论研究的深入和植物转基因技术的不断成熟,转基因植物疫苗的发展呈现出新的态势。已有研究表明,植物转基因疫苗口服免疫后不但可以诱导机体产生体液免疫、细胞免疫,而且可以诱导机体产生机体免疫[2-3]。ETEC的主要毒力因子为肠毒素(ST、LT)和定居因子K88、K99、987P、F41。在定居因子与肠壁细胞特异受体结合的前提下,ETEC产生的肠毒素可引起肠壁细胞发生功能性障碍,造成幼龄动物腹泻。致仔猪腹泻的定居因子80%以上属于K88ac型,STⅡ是唯一猪源ETE...  (本文共5页) 阅读全文>>

《中国预防兽医学报》2008年02期
中国预防兽医学报

大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与表达

仔猪腹泻病是多年来影响我国畜牧业发展的重要疫病之一,经过几十年的深入研究,发现产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Eschcrichia coli,ETEC)是引起婴幼儿及幼畜急性腹泻的主要病因。ETEC的毒力因子包括黏附素、肠毒素、水肿病毒素、内毒素、溶血素等[1]。其中黏附素与肠毒素无论是从发病学还是免疫学角度看,都扮演着重要的角色。K88黏附素据其免疫学特征,可分为K88ab、K88ac、表1所用菌株与质粒Table1Bacteria and plasmidBacteria and plasmidEscherichia coliSalmonella typhimuriumPlasmidRevelant genotypeTop10amp+DE3(pET-KS)kna+DE3(pET-K88ac)kna+X6212(pYA3334)X4550(Cya-,crp-,asd-)pBS-T amp+Sourceour...  (本文共5页) 阅读全文>>

石河子大学
石河子大学

转融合基因K88ac-STⅡ-LTA2/LTB苜蓿的获得及其外源K88ac蛋白的检测与分析

目的:产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxin Escherichia coli,ETEC)是引起幼畜腹泻的主要病原之一,给畜牧业生产尤其是养猪业造成了巨大的经济损失。研究表明,K88ac菌毛和LT、ST肠毒素是产肠毒素性大肠杆菌主要的致病因子,它们在幼畜腹泻疫苗研制中具有重要的作用。多年生草本植物苜蓿,产量高,适口性好,不含动物毒素和病毒,且其青贮技术非常成熟。因此选择苜蓿作为生物反应器生产抗腹泻口服疫苗具有十分重要的意义。方法:本论文研究以金皇后苜蓿品种为试验材料,以实验室已经建立的再生体系为基础,对影响农杆菌介导的苜蓿遗传转化因素进行优化,建立了高效的遗传转化体系。同时对转基因苜蓿外源蛋白的免疫原性和稳定性进行研究。结果:1.建立了紫花苜蓿遗传转化体系:以农杆菌叶盘介导法为基础,通过对苜蓿的环节进行优化。确立了外植体预培养时间为3d,农杆菌菌液浓度OD为0.5,筛选剂Kan浓度第一阶段和第二阶段分别为30和50mg/L,...  (本文共50页) 本文目录 | 阅读全文>>

《新疆农业大学学报》2004年04期
新疆农业大学学报

K88ac-STⅡ融合基因的克隆与测序

采用基因融合的方法将免疫蛋白与某种抗原决定簇构建成重组疫苗有了新的进展[1~3]。将一些致病性的病毒蛋白或毒素的抗原表位插进外膜蛋白[4~6]、某些菌毛蛋白[7~10]和鞭毛蛋白[11]中。大肠杆菌菌毛蛋白K88ac和肠毒素STⅡII是仔猪黄痢和仔猪白痢的主要病原之一。菌毛位于细菌菌体表面,有很强的免疫原性,本研究利用致病性大肠杆菌菌毛抗原蛋白K88ac作为外源抗原STⅡ表位的载体,使杂合蛋白更易于接触宿主肠道黏膜免疫系统,从而有效的预防致病性大肠杆菌的感染。1 材料与方法1.1 材料K88ac+冻干苗由宁夏大学许宗波教授赠送,宿主菌大肠杆菌DH10B由中科院遗传所赠送,克隆载体PBS T、DNA回收试剂盒及pfuTaqDNA聚合酶购置于北京天为时代公司,NcoI/XcoI酶、BsaJI酶购自北京华美公司。1.2 方法1.2.1 K88ac菌的培养无菌条件下接种K88ac菌种于25μg·ml-1氨苄青霉素LB固体培养基上,37℃...  (本文共4页) 阅读全文>>

石河子大学
石河子大学

大肠杆菌K88ac-ST Ⅱ融合基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的表达与免疫

为了构建表达大肠杆菌菌毛蛋白K88ac和热稳定肠毒素STII融合基因的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,并对其免疫效果进行研究。根据GenBank中登录号为m29375的K88ac基因序列以及减毒鼠伤寒沙门氏菌原核表达载体pYA3334的多克隆位点设计特异性引物P1、P2,并在上下游引物的5’端分别引入NcoI和BamHI酶切位点,从大肠杆菌DE3(pET- K88ac-STⅡ)中通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到K88ac-STⅡ融合基因。回收纯化后将K88ac-STⅡ融合基因用T4DNA连接酶连于克隆载体pBS-T上,热击转化受体大肠杆菌Top10,蓝白斑筛选阳性菌落,酶切鉴定证明其中含有K88ac-STⅡ融合基因片段,再测序鉴定该融合基因序列的正确性,命名为pBS-K88ac-STⅡ。之后采用缺失腺苷酸环化酶基因(Δcya)、环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶基因(Δasd)的鼠伤寒沙门氏菌(X45...  (本文共69页) 本文目录 | 阅读全文>>