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玻璃化冻存对小鼠骨髓有核细胞生物学特性的影响

本文以成年ICR小鼠为实验材料,用玻璃化方法对骨髓有核细胞进行液氮(-196℃)冻存。通过两部分的研究以探索文中所采用的玻璃化冻存技术对骨髓有核细胞的影响,一方面通过检测冻存后细胞的回收率、存活率、线粒体内琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性、细胞中过氧化氢(H_2O_2)含量和细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性以观察玻璃化冻存对骨髓有核细胞存活率和多种酶活性的影响;另一方面通过体外培养玻璃化冻存后的骨髓有核细胞,检测其贴壁率和细胞生长曲线,通过传代纯化、扩增骨髓间质干细胞,从形态学角度观察冻存后骨髓间质干细胞生物学功能的变化。(1) 玻璃化冻存程序:用两步预平衡法对骨髓有核细胞进行玻璃化冻存,在室温(20℃)下将骨髓有核细胞放入50%浓度的玻璃化溶液中,平衡5min,然后把细胞移入4℃水浴中,继续加入玻璃化溶液,使其终浓度达到90%,继续平衡5min后,把细胞悬液分装入塑料冻存管中,直接投入液氮(-196℃)保存。在冻存1~30d后,  (本文共55页) 本文目录 | 阅读全文>>

《中国科学:生命科学》2019年01期
中国科学:生命科学

最小体积玻璃化冻存技术在生物医学领域的进展和应用

生物冷冻保存是指在超低温条件下对细胞和组织为此,冻存过程中使用的冷冻保护剂(cryoprotectant实现长期保存.冷冻保存在现代医学中已被广泛使用,agent, CPA)起着至关重要的作用. CPA不仅可避免或如对人生殖能力的保存[1~4]、移植细胞或组织的保减少降温过程中冰晶形成,且作为一种渗透压缓冲存[5~7]以及对组织再生和细胞治疗中的细胞或组织储剂[21~24]可阻止冻存过程中较大电解质浓度梯度的产存[8~11]等.迄今为止,研究人员已在冷冻保存技术的改生,最终对细胞活性起到保护作用[25~27].此外, CPA还进以及多种细胞/组织(如胚胎[12,13]、肝细胞[14,15]、干可以稳定细胞膜,保持生物大分子的天然形态[27~29].细胞[16,17]和血管[18~20])冻存方法的优化等方面做出了目前使用较广泛的CPA主要包括二甲基亚砜(dimethyl巨大努力.sulfoxide, DMSO)、1,2-丙二醇(...  (本文共18页) 阅读全文>>

宁夏医科大学
宁夏医科大学

卵巢玻璃化冷冻及移植过程中自噬对卵泡存活的作用研究

目的:医疗技术的提高使得癌症患者的存活率显著增加,随之而来的是癌症患者对生育力保存的需求也大大增加。卵巢组织玻璃化冻存后移植,也成为癌症患者生育力保存的重要方法之一,尤其是对青春期前女性,卵巢组织玻璃化冻存是她们保存生育力的唯一可选途径。但是,冻存后卵巢组织复苏后移植到女性体内,会出现较高的异常卵母细胞和卵巢空泡化的现象。因此,保护移植后的卵巢组织中的卵泡,特别是原始卵泡就显得尤为重要。已有研究表明自噬可以抗深低温损伤进而保护细胞存活,而且Ⅱ型程序性细胞死亡-自噬(autophagy),参与调控各级卵泡的闭锁,但是自噬在卵巢组织玻璃化冻存及移植过程中对卵泡是如何作用的,其作用机制是什么,尚不清楚。本研究拟以21日龄雌性ICR小鼠卵巢为模型,应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA,抑制自噬体的形成)、巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1,Baf1,与溶酶体结合抑制自噬体的降解)和自噬激活剂雷...  (本文共73页) 本文目录 | 阅读全文>>

《第一军医大学学报》1999年06期
第一军医大学学报

体内、体外产生的小鼠桑葚胚玻璃化冻存后的发育能力

通常采用的胚胎冻存技术不能避免在冻结和融解过程中产生的冰晶对胚胎的损伤,这是引起胚胎细胞死亡的主要因素之一[1,2]。人们发现含高浓度冻结保护剂的溶液在冻结过程中可以由液态变为一种玻璃化(vitrification)的非结构状态,并且保持液态的分子和离子分布。Rall等[3]首次报道在4℃时小鼠胚胎逐步暴露于含有4种冻结保护剂的玻璃化溶液后,再置入液氮中保存,融解后胚胎成活。Kasai[4]等发现体内产生的不同发育时期的小鼠胚胎在室温下直接暴露于含乙烯甘醇、Ficoll和蔗糖的玻璃化溶液中,冻融后存活率为62%~98%。到目前为止,包括人胚胎在内的13种哺乳动物胚胎已玻璃化冻存成功[2,5,6]。本研究的目的在于观察体内、体外产生的小鼠桑葚胚玻璃化冻存后的发育能力,寻找更适合体外受精产生胚胎的玻璃化冻存方法。1材料与方法11化学试剂所有化学试剂除非特殊注明均为Sigma公司产品(StLouis,MO,USA)。12体外桑葚胚的来...  (本文共4页) 阅读全文>>

大连理工大学
大连理工大学

神经干细胞玻璃化冻存及其生物学特性的研究

神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)的低温冷冻保存对于通过移植NSCs治疗急、慢性脊髓损伤以及多种神经系统疾病具有广阔的临床应用前景。为改善NSCs的冷冻保存效果,本课题拟对体外培养的NSCs的玻璃化冻存方案进行优化,并分析其冻存后的生化特性。本文根据NSCs体积的变化确定了渗透平衡时间,将冷冻保护剂(Cryoprotective agent, CPA)分别于常温(23°C)、低温(0°C)下分六步导入单细胞悬液中,随后进行玻璃化冻存实验。台盼蓝与CCK-8分别用于检测细胞活率及增殖能力。流式细胞仪与Hoechst 33342/Ca/PI荧光染色用于更直观地检测冻后细胞的活率。Annexin V/PI与免疫组化分别检测冻后细胞凋亡及分化情况。尝试用蛋黄代替二甲基亚砜(DMSO),设计一种新型低毒性CPA。通过记录NSCs在NaCl溶液中的渗透反应,计算出水分对于细胞膜的渗透系数(Lp),从而为三参数的确定...  (本文共77页) 本文目录 | 阅读全文>>

大连理工大学
大连理工大学

海藻糖对神经干细胞玻璃化冻存过程影响的研究

为获得来源方便的神经干细胞,开展有效的干细胞移植及建立干细胞库,需长期低温保存神经干细胞。本文研究了神经干细胞在培养过程中海藻糖的影响和海藻糖的玻璃化能力,并进行神经干细胞的玻璃化冻存过程的研究。首先,对海藻糖在神经干细胞培养过程的影响进行了研究。在神经干细胞培养过程中分别加入0mol/L、0.3mol/L、0.15mol/L、0.075mol/L、0.05mol/L、0.025mol/L的海藻糖,通过CCK-8试剂盒连续六天进行测试,结果显示在神经干细胞培养过程加入海藻糖不会影响细胞的增值,同时保持了其干细胞的特征,并且可以诱导分化为神经元、少突胶质细胞、星型胶质细胞,从而确保了海藻糖应用于神经干细胞玻璃化冻存的安全性。其次,通过低温冷台和差示扫描量热实验,对海藻糖与蔗糖的玻璃化能力进行了比较,主要考察了玻璃化转变温度和反玻璃化的情况。在低温冷台上在100℃/min降温速率下,60%海藻糖和60%蔗糖均能实现玻璃化,但在以相同...  (本文共77页) 本文目录 | 阅读全文>>