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牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定与巢式-PCR诊断方法的建立

从济南周边奶牛养殖小区发生呼吸道症状的荷斯坦奶牛中,采集样品,按常规方法处理后,接种MDBK细胞,盲传4代后,分离到一株牛传染性鼻气管炎病毒。分离到的病毒在细胞上培养36h后,可形成直径为1.0~1.5mm的噬斑。将病毒超离心浓缩后,在电镜下可以观察到具有牛传染性鼻气管炎病毒典型特征的病毒粒子;病毒可被牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清中和;用IBRV特异性引物经PCR扩增出了其gB基因的高保守区,测序结果与GeneBank登陆号AF258347的序列完全吻合。通过以上试验均证实本次所分离到的病毒为牛传染性鼻气管炎病毒,命名为SD-IBRV。另外本试验还从该地区采集了217份牛血清样品,进行了血清流行病学调查,结果表明该地区牛传染性鼻气管炎病毒血清阳性率为28.6%(62/217)。以上研究为该病的诊断和防治提供了一定的依据。目前牛传染性鼻气管炎病毒的诊断方法主要有:病毒的分离培养、中和试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验( ELIS  (本文共55页) 本文目录 | 阅读全文>>

中国农业科学院
中国农业科学院

节瘤拟杆菌早期鉴别诊断—PCR检测方法的建立与应用

腐蹄病是危害反刍动物养殖业发展的重要疾病之一,瘤拟杆菌(D.nodosus)是引起牛、羊、鹿等反刍动物腐蹄病的原发性病原菌,为指导疫苗预防需要建立D.nodosus的早期鉴别诊断技术。本研究根据节瘤拟杆菌特有保守序列设计引物,利用聚合酶链式反应(PCR)建立了一种简单区分该菌菌群的检测方法。(1)比对纤毛蛋白基因相关序列,依据Ⅰ,Ⅱ菌群的保守序列,设计了可区分两大菌群的三条引物,其中上游引物共用,下游引物分别对两大菌群特异。(2)对可能影响PCR反应的一系列因素进行了较详细的研究,选择了适宜PCR反应的快捷处理病样及血样获得反应模板的方法:病样离心分离细菌,2TE—1%TritonX—100煮沸裂解细菌,离心取上清作模板;用EDTA抗凝血样,温和裂解红细胞,离心沉淀细菌,以后操作同病样处理。对PCR反应条件进行了优化:选3个因素Mg~(2+)、引物、Taq酶,各3个水平,9个反应组合,选出最佳反应条件,95℃2分钟;94℃35秒...  (本文共44页) 本文目录 | 阅读全文>>

四川大学
四川大学

巢式PCR法研究马拉色菌在花斑癣中的分布和构成

马拉色菌(Malassezia)是寄生于人类和某些动物皮肤的嗜脂性酵母菌。在一定外源性和内源性因素下可引起花斑癣(Pityriasis Versicolor, PV),新的分类方法将马拉色菌分为7个种以来,从PV患者分离到菌种构成的研究国内外均有报道,但结果很不一致,以往的研究方法多为培养法,受不同菌种的生长速度不同,以及存在菌种的覆盖和培养基选择性等因素的影响。目的:用巢式PCR法检测马拉色菌特异的DNA从而快速准确的检测并鉴定马拉色菌的各菌种,并应用于花斑癣患者皮屑中马拉色菌携带情况中的研究。方法:从PV患者的皮屑中提取马拉色菌的DNA,以马拉色菌属rRNA内转录间隔区设计的属的引物和各个种的特异性引物分别进行巢式多聚酶链反应(nest-PCR),检测105例PV患者皮屑中的马拉色菌的目的DNA片断。结果:105例PV患者共检测到5个种的共311株马拉色菌的DNA。每例患者平均检测到约3种马拉色菌的DNA。各种马拉色菌的检出...  (本文共33页) 本文目录 | 阅读全文>>

河北农业大学
河北农业大学

PCR技术检测测乳品中金黄色葡萄球菌研究

金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病源菌之一,国内外由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒屡屡发生。引起食物中毒的食品多为动物性食品、乳及乳制品等。目前,国内检测食品中金黄色葡萄球菌仍采用传统的方法,其操作繁琐,检测时间较长,通常需要3~5d才能完成,且灵敏度较低。本研究针对食品中金黄色葡萄球菌PCR检测的特殊性,建立了快速检测乳品中金黄色葡萄球菌的PCR方法,消除PCR反应抑制因子,缩短食品中金黄色葡萄球菌的检测时间,提高检测方法的灵敏性,为金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病的快速诊断提供技术支持。本研究以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)为靶基因,选择特异性引物,进行PCR扩增,检测乳品中的金黄色匍萄球菌。对PCR反应体系中镁离子浓度、模板量及退火温度和循环数进行优化,以确定适宜PCR反应体系和PCR扩增程序,其适宜反应体系为:5μl 10XPCR buffer(200mM Tris-HCl[pH 8.3], 500mM K...  (本文共52页) 本文目录 | 阅读全文>>

四川农业大学
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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及PCR检测方法的建立

本研究从重庆某猪场病猪的肺脏、胸腔渗出液等材料中成功分离和鉴定了3株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。试验结果表明,分离株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌为革兰氏阴性,呈短杆菌和球杆菌等多种形态;该菌在普通营养琼脂、麦康凯琼脂培养基上不能生长;在兔血琼脂培养基上培养,形成β溶血的细小菌落;在兔血巧克力琼脂培养基上培养,可形成透明的1-2mm大小的菌落;在胰胨大豆胨(TSA)培养基上培养,能形成乳白色菌落;在加V因子的普通营养琼脂培养基上培养,菌落呈乳白色;分离株细菌培养需要加入V因子,尿素酶阳性,MR、VP和吲哚试验呈阴性。动物试验表明分离株具有致病性,能引起猪发生典型的胸膜肺炎症状。试验以自制的APP标准阳性血清,对分离的细菌进行琼脂扩散试验分型检测,结果表明猪胸膜肺炎放线杆菌分离株MC为血清3型;ME为血清7型;MH为血清型9型。本研究针对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的ds bE-like基因设计了1对特异性的引物,成功建立了PCR检测APP的...  (本文共29页) 本文目录 | 阅读全文>>

吉林大学
吉林大学

应用PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌

致病微生物污染食品而引起的食物中毒是直接造成人体健康损害的主要食源性危害因素,而金黄色葡萄球菌肠毒素引起的中毒占整个细菌性食物中毒的首位,但目前尚缺乏理想的,特别是快速的检测方法,因此易造成实验室漏检和临床诊断的延误。本研究利用国家标准规定的方法(GB4789.10-2003)和PCR方法分别对采自吉林省9个地区的180份食品样品进行了检测,初步了解了我省食品中金黄色葡萄球菌的污染情况,并对两种监测方法进行了比较,以期找到一种更加快速、敏感、特异、理想的检验方法。实验结果表明,PCR方法检测出阳性样品为45份,阳性率25%,其中鱼和熟食的阳性率最高皆为40%,袋装牛奶未检出;国标法检测出阳性样品为42份,阳性率23.3%,其中散装牛奶的阳性率最高为37%,袋装牛奶和蔬菜均未检出。PCR检测法与国标法的阳性率无显著性差异(?2=3.0,P﹥0.05)。本研究所建立的PCR方法是针对金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶编码基因(nuc基因)设...  (本文共53页) 本文目录 | 阅读全文>>