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牛肠激酶催化亚基cDNA的克隆、表达及表达产物的纯化和应用

肠激酶(enterokinase, EK)是一种以异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶,可沿胰蛋白酶原序列中(Asp)4 –Lys的羧基端切下,从而释放出活性胰蛋白酶。正是肠激酶在体内表现出的这种高度的酶切特异性使其成为当前基因工程领域融合蛋白表达后切割与纯化的重要工具之一。较之目前裂解融合蛋白常用的凝血酶、Xa因子等蛋白酶和溴化氰、羟胺等化学试剂,肠激酶具有非特异性切割极少,反应条件宽泛,切割位点在全部识别序列之后,切出的目标产品首位氨基酸可完全忠实于天然蛋白等特点。本文首次对中国北方黄牛肠激酶基因催化亚基(EKL)编码序列的cDNA进行了克隆并分别在大肠杆菌与毕赤酵母中实现了表达,得到如下结果:首先从市售中国北方黄牛十二指肠组织中提取总RNA,以RT-PCR方法扩增其cDNA片段,将此片段克隆于pGEM?-T Easy载体中,经过特异性限制性内切酶酶切分析片段正确后,进行全序列分析。结果表明克隆的cDNA与G  (本文共147页) 本文目录 | 阅读全文>>

《生物技术通讯》2006年01期
生物技术通讯

重组牛肠激酶轻链基因在毕赤酵母中的表达与纯化

目的:构建重组牛肠激酶轻链的基因工程菌,并进行表达和纯化,以获得高纯度和高活性的重组牛肠激酶轻链蛋白。方法:以GenBank公共数据库中的牛肠激酶轻链基因序列(AccessionNo.NM174439)设计引物,利用RT-PCR合成牛肠激酶轻链基因片段,并克隆进p...  (本文共4页) 阅读全文>>

《科技通报》2006年06期
科技通报

重组肠激酶在大肠杆菌中的发酵与纯化

对重组肠激酶在大肠杆菌中的高密度发酵表达条件、纯化方法及其生物活性测定进行了研究。结果表明:在E.coli表达系统中,控制温度为37℃,培养...  (本文共4页) 阅读全文>>

《生物技术》2005年06期
生物技术

重组牛肠激酶轻链基因在大肠杆菌中的表达与纯化

肠激酶(Enterokinase,EK,EC3.4.21.9)是一种以异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶,通过在位点(Asp)4-Lys的羧基端进行高效特异酶切,将胰蛋白酶原激活为胰蛋白酶。以GenBank公共数据库中牛肠激酶轻链基因序列(Acces-...  (本文共5页) 阅读全文>>

《安徽农业科学》2003年05期
安徽农业科学

牛肠激酶次特异性识别序列分析

在酶切融合蛋白时 ,除正常切割和非特异性切割以外 ,发现...  (本文共3页) 阅读全文>>

《烟台大学学报(自然科学与工程版)》2008年01期
烟台大学学报(自然科学与工程版)

人肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

研究目的:克隆表达人肠激酶轻链编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化.方法:从人的全基因组中扩增出编码人肠激酶轻链的5个外显子基因片段,经过酶切、连接后得到正确编码的人肠激酶轻链完整基因序列;随后,将目的基因片段插入原核表达载体pBV220中,构建成融合型表达载体pBV...  (本文共6页) 阅读全文>>