分享到:

抗牛精子膜蛋白单链抗体基因的克隆与表达

由于精子膜蛋白结构上的多形性、功能上的复杂性,加之缺乏有效的分离纯化手段,有关精子膜蛋白的研究一直是一个难点。sp18是由本实验室首次发现的一组牛精子膜蛋白,由于尚未纯化得到sp18,有关sp18的研究难以突破。为此,本研究从分泌抗sp18单抗的杂交瘤细胞入手,欲克隆其抗体基因并分析其序列特征,以此推测其针对的抗原性质。应用重组噬菌体抗体库技术,从分泌小鼠抗牛精子sp18抗体的杂交瘤细胞系中分离总RNA,克隆抗体重链和轻链可变区基因,加入连接肽引物(Linker primer)组装成单链抗体ScFv(single chain fragment variable)基因并用RS引物进行扩增,Sfi Ⅰ、Not Ⅰ酶切,回收后与pCANTAB5E载体相连,转化E.coli TG1宿主菌,构建单链抗体文库。经辅助噬菌体M13K07超感染,将ScFv展示于噬菌体表面。以牛精子作为包被抗原,经过三轮“亲和吸附-洗脱-扩增”的淘选后,进行ph  (本文共101页) 本文目录 | 阅读全文>>

河北北方学院
河北北方学院

载脂蛋白A1在精子中的表达及其与精子活力的关系

为了研究免疫性不育的相关机制,本课题小组在前期工作中应用免疫共沉淀结合液相色谱串联质谱技术,筛选与不育相关的精子膜蛋白,通过生物信息软件对其进行分析,筛选出15种与不育相关的精子膜蛋白。我们对其中一种蛋白:载脂蛋白A1(Apolipoprotein A1,APOA1)进行分析,研究其在精子中的定位及相关功能。收集来自中国人民解放军总医院健康查体男性精液标本26例。采用PCR技术和免疫印迹技术从分子和蛋白水平检测APOA1的存在,并采用免疫荧光共聚焦显微镜观察APOA1在人精子中的定位。设空白对照组、兔多克隆抗体IgG组和10、20和40μg/ml的APOA1抗体处理精液标本,37℃温箱孵育精子1、2和3 h后,通过精液分析仪观察精子前向运动变化,AnnexinⅤ检测精子的凋亡率和JC法检测精子线粒体膜电位变化。40μg/ml的IgG抗体和APOA1抗体分别孵育小鼠精子1h后,进行小鼠体外受精实验,观察两组受精率的差异。收集不同活...  (本文共57页) 本文目录 | 阅读全文>>

甘肃农业大学
甘肃农业大学

冷冻前后牦牛精子质量与HSP家族基因表达的相关性研究

人工授精(Artificial insemination,AI)技术是提高家畜繁殖效率的重要环节,因此筛选获得高质量的冻精非常重要。然而,冻融过程导致精子品质降低,繁殖力下降,影响了良种公牛种用价值,而且增加养殖成本。以往研究表明,细胞及生物体可通过合成热应激蛋白HSPs来保护细胞免受外界伤害,且HSPs的表达水平与公畜的受精率密切相关。目前,尚无关于牦牛HSP70和HSP90与精子品质相关性的报道。本研究以牦牛鲜精和冻融精子为试验材料,经45%Percoll单层梯度液纯化后,通过检测和分析牦牛精子质量和精子内酶活性差异,采用qRT-PCR、Western Blot和免疫荧光技术检测HSP70和HSP90表达情况,并分析牦牛HSP70和HSP90表达量与精子质量的相关性,为牦牛精子质量和繁殖力的高低进行标记辅助评价提供科学依据。主要研究结果如下:1.试剂盒(RNeasy Kit)、热TRIzol和TRIzol一步法都可以获得牦牛...  (本文共74页) 本文目录 | 阅读全文>>

中国协和医科大学
中国协和医科大学

两种精子膜蛋白的基因表达研究

应用免疫途径控制生育已成为近年来迅速发展的一个领域,将精子膜的关键抗原纯化后作为避孕疫苗的设想是十分诱人的。但是鉴于精子来源困难,分离纯化精子膜蛋白受到了极大的限制。因此应用基因工程的手段,制备精子膜蛋白抗原,进而制备抗生育疫苗已成为必然的趋势。精子膜蛋白的基因工程工作起步较晚,截至1989年底,国外除了美国和加拿大的Herr及Lee开始进行了精子膜的基因研究外,其他尚未见报道。我室在以前工作的基础上用表位筛选法,首次自表达型噬菌体载体λgt11构建的大鼠睾丸cDNA库中筛选出了编码兔精子膜蛋白rSMP-B的cDNA片段(RSD-1)和编码人精子膜蛋白YWK Ⅱ抗原的cDNA片段(RSD-2)。本文采用所分离到的这两个精子膜蛋白cDNA基因片段,借助重组DNA质粒转染中国地鼠卵巢细胞(CHO cell),研究了精子膜蛋白基因在哺乳动物细胞中的表达,并应用原位杂交方法,探讨了这些膜蛋白基因在精子发生过程的表达。对pSV_2dhfr...  (本文共74页) 本文目录 | 阅读全文>>

《中国医学科学院学报》1982年02期
中国医学科学院学报

精子膜蛋白的研究——Ⅲ、兔精子膜蛋白“A”的定位及其酯酶活性的观察

利用异硫氰荧光素-蛋白A的免疫荧光抗体技术,确定了兔精子膜蛋白“A”的定位,证明它是...  (本文共4页) 阅读全文>>

华东师范大学
华东师范大学

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)精子膜蛋白抽提及组成分析

精子膜蛋白是与精子发生、成熟、获能,精卵粘附与识别,顶体反应以及精卵融合等过程相关的重要蛋白。本研究采用两种不同的抽提方法(TritonX-114液相分离法和TM-PEK法)来抽提中华绒螯蟹精子膜蛋白,对两种方法得到的膜蛋白先进行SDS-PAGE银染分析,而后以膜蛋白标志蛋白抗体(Flotillin-1单克隆抗体与Na+/K+ATPase单克隆抗体),细胞质标志蛋白抗体(GAPDH单克隆抗体)作为检测依据进行western blot分析,通过比较两种方法的抽提效率,初步确定了中华绒螯蟹精子膜蛋白的抽提方法和条件。再进一步进行Nano-LC MS/MS来得到中华绒螯蟹精子膜蛋白质组的详细构成,并做一系列的生物信息学分析。在本研究中,我们识别出了181个有高信度的GO注释膜蛋白,包括大部分已知道的哺乳动物生殖标记分子(比如LDH-C4, serine protease inhibitor, Angiotensin-convertin...  (本文共70页) 本文目录 | 阅读全文>>