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鸡X期胚盘细胞体外培养与输卵管生物反应器的研制

鸡输卵管生物反应器研制已成为转基因研究热点之一。人们尝试应用多种方法研制鸡输卵管生物反应器,但至今没有取得令人满意的效果。因此探索更为有效的转基因鸡制备途径已成为目前研究的一个重要课题。应用鸡内源性的调控元件指导外源基因在鸡输卵管特定的表达是研制鸡输卵管生物反应器的一种全新策略,需要对家禽多能细胞体外长期培养和遗传修饰。因此本研究首先对胚盘细胞的进行体外培养、标记,探索对鸡早期胚盘细胞遗传修饰技术,继而构建可用于输卵管生物反应器研制的表达载体,取得如下结果:1.克隆寿光鸡cENS2基因的U3R调控区,序列分析表明该调控区含有CES细胞特异的增强子B区;U3R调控区与pEGFP-N载体融合构建了鸡CES细胞特异表达载体pEGFP-cENS2-Promoter,通过转染胚盘细胞、CEF细胞验证其特异的启动子活性。2.应用pEGFP-cENS2-Promoter转染不同区域的胚盘细胞从而从分子水平确定CES细胞或其前体细胞主要分布在胚  (本文共106页) 本文目录 | 阅读全文>>

郑州大学
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tPA乳腺特异性表达载体的构建及其瞬时表达

血管栓塞性疾病是当前危害人类健康导致死亡的主要原因之一。目前,国产正式应用于临床溶栓治疗的纤溶酶原激活剂主要有尿激酶(Urokinase,UK)和链激酶(Streptokinase,SK),而尿激酶和链激酶的溶栓效率有限且因无纤维蛋白结合特异性,易发生治疗性出血。组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)是人体内生理性纤溶酶原激活剂,与尿激酶和链激酶相比,人tPA与血栓基质有很高的特异性亲和力。tPA能在血栓局部激活纤溶酶原,使其转化成具有生物活性的纤溶酶,后者可水解血栓的基质—纤维蛋白,使凝血块溶解,血管再通,并且不引起血纤溶酶原的系统性激活,因而大大降低了治疗过程中出血的危险,是一种用于治疗急性心肌梗死等血栓性疾病的特效药品。tPA除了参与体内溶血和凝血的平衡调控外,还与其它一些重要的生理与病理过程密切相关,如组织再造、细胞迁移、排卵、补体激活、激肽产生、肿瘤侵袭等。正...  (本文共121页) 本文目录 | 阅读全文>>

扬州大学
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表达人组织激肽释放酶鸡输卵管暂态生物反应器的研究

为了构建鸡输卵管特异表达载体,根据已经发表的鸡卵清蛋白基因5′-和3′-调控区序列设计两对引物,用高保真PCR法从中国狼山鸡基因组DNA中分别扩增出长度各为3.0kb的卵清蛋白基因5′-和3′-调控区,将扩增产物克隆入pGEM-T载体,部分序列测定结果证明与国外发表的鸡卵清蛋白基因相应区域同源性为100%。将鸡卵清蛋白基因5′-和3′-调控区插入粘粒载体pHC20,获得的鸡输卵管特异表达载体命名为pOV1。为了证明构建的载体能有效驱动目的基因在鸡输卵管上皮细胞中表达,将绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因通过Xho Ⅰ位点克隆入pOV1载体,将获得的重组载体pOV1EGFP与脂质体或多聚阳离子(PEI)包裹后,分别转染产蛋鸡输卵管上皮细胞和成纤维细胞,转染后48 h在荧光显微镜下观察报告基因的表达,结果证明pOV1载体能有效驱动EGFP报告基因在输卵管上皮细胞中表达,而在鸡成纤维细胞中不表达。为了进一步优化pOV1载体的结构,用限制...  (本文共110页) 本文目录 | 阅读全文>>

吉林大学
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柯萨奇病毒B4单、双siRNA表达载体的构建及其抗病毒作用研究

本文选择柯萨奇病毒B4(CVB4)为研究对象,构建了具有U6启动子的CVB4的P1A、P2A、P2B、P3D基因的单siRNA表达载体,在培养细胞内通过细胞病变效应的观察、收获病毒的TCID50、蛋白表达量和mRNA表达水平的测定检测了单siRNA表达载体对CVB4的抑制作用,并检测了转染单siRNA表达载体后不同时间用CVB4感染细胞单siRNA表达载体对CVB4的抑制作用。在此基础上,选择可有效抑制CVB4复制的单siRNA表达载体,转移其表达siRNA的基因片段,构建以CVB4 P1A、P2A为靶基因的双siRNA表达载体pU6/d-siRNA /neo/GFP/C1A-2A,检测双siRNA表达载体在培养细胞中对CVB4的抑制作用并比较其与单siRNA表达载体抑制作用的不同。通过尾静脉注射法将pU6/d-siRNA /neo/GFP/C1A-2A注射入小鼠体内24h后,腹腔注射CVB4病毒,同时设正常对照组和pU6/d-...  (本文共115页) 本文目录 | 阅读全文>>

中国协和医科大学
中国协和医科大学

靶向NRas和c-Myc的shRNA表达载体的构建及其抗肿瘤活性研究

RNA干扰已经发展成为一种非常有潜力的肿瘤基因治疗手段。用于治疗的RNA干扰物质主要有化学合成siRNA和shRNA表达载体。在体内shRNA表达载体具有更稳定的RNA干扰作用,便于进行较长时间的基因功能研究。shRNA表达载体法分为病毒载体法和非病毒载体法两种。shRNA病毒表达载体的转染效率高,但安全性低。因此研究安全性较高的shRNA非病毒表达载体是很有必要的。一、一种可同时表达多种shRNA的载体pCSH1的设计与构建shRNA非病毒表达载体安全性高,但它转染效率较低。主要原因是质粒DNA难于从细胞质进入细胞核,可通过降低质粒的大小来改善。质粒DNA在细胞内可以促发干扰素效应,引起非特异毒性,可通过降低质粒的用量来解决。我们构建了用于治疗的shRNA非病毒表达载体pCSH1,在设计时注意了尽量提高RNA干扰的效率和尽量降低载体的非特异毒性两个问题。载体采用了pUC19的质粒基本序列,RNA聚合酶Ⅲ识别的H1启动子,以使载...  (本文共101页) 本文目录 | 阅读全文>>

吉林大学
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HBsAg真核表达载体的构建及在CHO细胞高效表达的研究

以pCI和pCIneo为起始质粒,通过改造目的基因及表达载体,对CHO细胞系统高效表达乙肝表面抗原进行了初步探索。结果显示,通过更换启动子、引入内含子、去除目的基因的5′和3′非翻译区、弱化抗性标记基因、改造目的基因中的稀有密码子等方法,成功构建了乙型肝炎病毒表面抗原S基因的新型表达载体。将构建的表达载体分别转染到CHO/dhfr-细胞中,均表达出了乙型肝炎表面抗原(HBsAg),经三轮梯度加压筛选获得抗性细胞群。单层培养分泌动态研究表明其HBsAg表达量稳定在512~1024/两天,比原有生产细胞株HBsAg表达量提高近2倍,为提高基因工程乙肝疫苗的产量奠定了实验基础。  (本文共110页) 本文目录 | 阅读全文>>