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腺病毒介导VEGF_(165)基因和eGFP基因共转染hBMSc对其体外增殖分化影响的实验研究

【目的】(1) 体外构建血管内皮生长因子VEGF_(165)基因腺病毒载体。(2) 对人骨髓基质干细胞(hBMSc)进行体外培养及扩增,观察其原代及传代细胞的生长特点及生物学特点。(3) 将VEGF_(165)基因腺病毒载体共转染hBMSc,观察其表达。(4)观察转染对hBMSc增殖、分化的影响。(5) 观察eGFP示踪转染效率及VEGF_(165)的表达。【方法】(1) 通过PCR方法人工合成VEGF_(165)的cDNA序列。合成完整的基因序列,测序。合成的VEGF_(165)两端带有EcoRⅠ和BamHⅠ位点,并克隆到pMD18-T载体中,对pMD18-T-VEGF_(165)进行双酶切。把含有pDNR质粒(含eGFP基因)的菌液接种到LB培养基,用试剂盒提质粒,得到的质粒进行EcoRⅠ和BamHⅠ的双酶切。回收5.6Kb左右的片段,与合成的带有EcoRⅠ和BamHⅠ位点的VEGF_(165)连接,过夜连接,转化感受态细胞  (本文共110页) 本文目录 | 阅读全文>>

《微生物学报》2017年10期
微生物学报

农杆菌介导的携带egfp基因载体转化寡雄腐霉

【目的】寡雄腐霉(Pythium oligandrum Drechsler)是一种对动、植物和环境无害,兼具杀菌和增产效果的生防真菌。通过研究建立农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化体系。【方法】选用EHA105、AGL-1、LBA4404三种农杆菌菌株对寡雄腐霉进行遗传转化研究,通过对影响遗传转化效果的条件参数试验优化,确立适宜寡雄腐霉遗传转化的农杆菌菌株及转化条件,建立农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化体系。【结果】经研究发现,所选3...  (本文共13页) 阅读全文>>

黑龙江大学
黑龙江大学

优化的重组杆状病毒对eGFP表达的影响

近年来,随着对杆状病毒研究的深入,其作为一种高效的载体宿主表达系统和基因转移载体,被人们广泛应用于外源蛋白在哺乳动物细胞中的表达,从而显示出作为非复制型载体的应用前景。本课题尝试将WPRE、ITRs、VSVGED三种元件同时加入到杆状病毒中进行遗传修饰和改造,探讨了其对外源基因表达的影响及其进行协同调控的效果。阐明CMV、CBA、EF]-α WSSViel启动子是否可以在哺乳动物细胞和禽类细胞中启动外源基因的表达,探讨启动子的启动效率、作用范围及对象,加深对哺乳动物细胞启动子的了解,这对启动子的研究将具有重要意义。本课题将分别具有CMV、CBA、EFl-α、WSSV iel启动子调控的eGFP报告基因表达盒与pPolH启动子相反的方向插入载体骨架,构建得到对照杆状病毒载体pX-control-eGFP。随后,在eGFP基因的3'非编码区中插入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE,用以增强eGFP基因的表达效率,由此得到重组杆状病...  (本文共133页) 本文目录 | 阅读全文>>

《中国蜂业》2008年07期
中国蜂业

利用egfp基因对中华蜜蜂卵进行显微注射的初步研究

利用显微注射法对中华蜜蜂0~12h卵注射绿色荧光蛋白基因,注射后的卵采取人工繁殖和蜂群自然培养两种方式...  (本文共2页) 阅读全文>>

黑龙江大学
黑龙江大学

杆状病毒高效表达载体构建及其介导eGFP在鸡胚原代细胞中的表达

Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统( Baculovirus Expression Vector System, BEVS)是一类真核表达系统。近年来,杆状病毒作为基因转移载体介导外源基因在哺乳动物细胞中表达已在生物、医学等领域得到广泛应用。杆状病毒载体在哺乳动物细胞中不复制,具有极高的生物安全性,而通过引入细胞特异性启动子、“病毒假型化”、添加不同功能调控元件等优化手段,杆状病毒可转导的细胞类型明显增多、转导效率明显增高。本研究以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)为报告基因,构建CMV启动子启动的重组转座载体,并且通过病毒假型化(TM/CTD of VSV-GED)、添加转录后调控元件(WPRE)和腺病毒反向重复序列(ITRs)等手段优化重组杆状病毒表达载体,最终利用重组杆状病毒对鸡胚原代细胞的侵染进行eGFP的表达,比较分析不同重组载体对蛋白表达水平的影响。首先,设计特异引物PCR扩增目的片段“PH”、“gp64SP”、“...  (本文共94页) 本文目录 | 阅读全文>>

《中国现代医学杂志》2010年07期
中国现代医学杂志

重组腺病毒pAdxsi-eGFP-rNIS的构建及初步应用

目的构建包含rNIS和eGFP基因的重组腺病毒载体及初步应用。方法以CMV为启动子,将pShuttle-eGFP-CMV重组穿梭载体和含有目的基因rNIS的原始质粒酶切后,电泳、切胶回收,分别得到载体片段和插入片段。连接酶连接两种片段后,转化化学感受态DH5a菌株,涂布到抗性固体培养基中;挑取单克隆菌落,接种到抗性液体培养基培养;提取pShuttle-eGFP-CMV-rNIS重组穿梭质粒,酶切鉴定。用类似的方法将pShuttle-eGFP-CMV-rNIS重组穿梭质粒转移到pAdxsi重组腺病毒骨架载体上。在细菌内...  (本文共5页) 阅读全文>>