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重组类人胶原蛋白的分离纯化

目的 建立重组类人胶原蛋白分离及纯化工艺。方法 将工程菌株E.coli BL21 3.1在L1523型12.8L自控发酵罐中培养14h,发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后,依次经DEAE-52和Sephadex   (本文共3页) 阅读全文>>

西北大学
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重组类人胶原蛋白(Ⅱ)分离纯化的工艺研究

蛋白质的分离纯化是生化分离工程的一个重要组成部分,本文主要研究重组类人胶原蛋白Ⅱ纯化工艺。基因工程菌E·coli BL 21经细胞破碎、沉淀、超滤分离后,再通过离子交换层析纯化,得到较高纯度类人胶原蛋白Ⅱ。在细胞破碎阶段,通过对细胞破碎方法的选择,系统研究了高压匀浆过程物理和化学因素的影响。包括操作方式、匀浆次数、操作压力、料液悬浮浓度的影响。从而选择采用高压匀浆法批式循环,经2次破碎,操作压力为70MPa、菌体悬浮液浓度为:菌体质量:水体积=1:10。建立破碎率随操作压力变化的方程S=1-(e~(0.058*2~(-0.005)p~(0.906))~(-1)。在沉淀阶段,通过单因素实验逐个确定沉淀各条件的范围,采用L_(16)(4~5)正交表,经方差分析确定沉淀条件为pH2.8,NaCl浓度5%、温度18℃,蛋白浓度5g/L。沉淀后,重组类人胶原蛋白Ⅱ的纯度达到37.68%,回收率达到88.73%。在超滤阶段,采用截留分子量为...  (本文共66页) 本文目录 | 阅读全文>>

西北大学
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重组类人胶原蛋白I的分离纯化研究

本文主要研究重组类人胶原蛋白Ⅰ的基因工程下游工艺。将基因工程菌E·coli BL21经高压匀浆、硫酸铵盐析、超滤浓缩后,得到类人胶原蛋白Ⅰ的粗品。再通过对离子交换批量层析与凝胶过滤层析相结合的方法和离子交换柱层析一步法进行比较,得到了获得高纯度类人胶原蛋白Ⅰ的优化工艺条件。1 粗提:采用高压匀浆法破碎20分钟,破碎率可达78.7%,破碎液中类人胶原蛋白浓度达2.56g/L;用饱和度范围为20~50%的硫酸铵盐析,采用L_9(3~4)正交表,经方差分析确定盐析条件为pH2.9,温度18℃,蛋白浓度3g/L,盐析后类人胶原蛋白纯度达36.8%,回收率达92.7%。2 纯化:采用了两种方法并进行了对比。(1)离子交换批量层析与凝胶过滤层析相结合。采用批量层析的操作条件为:选用DEAE-52阴离子交换树脂,用Tris-HCl缓冲液配置,在pH6.0、NaCl含量为0.2mol/L、蛋白进样浓度3g/L的条件下进行批量层析,吸附时间为60...  (本文共63页) 本文目录 | 阅读全文>>

西北大学
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重组类人胶原蛋白HCB1分离纯化研究

本文通过基因工程菌高密度发酵获得类人胶原蛋白胞内产物,通过菌体破碎及一系列处理分离和纯化类人胶原蛋白HCB1,得到了获得高纯度类人胶原蛋白的优化工艺条件。(一)粗提:采用超声破碎法破碎20分钟,破碎率可达87%,破碎液中类人胶原蛋白浓度达2.78g/L;用饱和度范围为15~65%的硫酸铵盐析,采用L_9(3~4)正交表,经方差分析确定盐析条件为pH 2.9,温度10℃,蛋白浓度2g/L,盐析后类人胶原蛋白纯度达36.8%,回收率达90.2%。(二)纯化:采用了两种方法并进行了对比。(1)离子交换层析与凝胶过滤层析相结合。采用批量层析的操作方法在pH7.5条件下用DE52树脂吸附杂蛋白,收集吸附后的上清液,经Sephadex G—100凝胶过滤层析柱,洗脱液为20mmol/L Tris—HCl(pH7.5含20mmol/L NaCl)缓冲液。可获得纯度为98%的类人胶原蛋白,总回收率为60.7%。(2)金属离子螯合亲和层析一步纯化...  (本文共58页) 本文目录 | 阅读全文>>

暨南大学
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重组类人胶原蛋白的表达纯化及在化妆品中的应用

目的:利用大肠杆菌系统表达重组类人胶原蛋白。优化中试发酵和纯化工艺,得到纯度90%以上的类人胶原蛋白,进行理化性质测定,建立体外活性测定方法检测蛋白活性。筛选类人胶原蛋白的稳定保护剂应用于精华液配方,并根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)技术要求,采用急性经皮毒性试验、皮肤变态反应试验、皮肤刺激性试验,测试其使用的安全性。方法:将编码重组类人胶原蛋白(hlcollagen)的DNA片段克隆到原核表达载体pET3c中,新构建并重组表达质粒pET3c-hlcollagen,将表达好的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,氨苄抗生素筛选法优选重组子。IPTG诱导表达,优化发酵条件,IPTG诱导表达,收集菌体,均质机破碎后通过NI柱亲和层析(Ni Sepharose 6 Fast Flow)和分子筛(Sephadex G-25)联用分离纯化得到重组类人胶原蛋白。针对hlcollagen对NIH/3T3细胞的促粘附活性,建立其活性...  (本文共68页) 本文目录 | 阅读全文>>

南京理工大学
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重组类人胶原蛋白基因工程菌发酵动力学

胶原蛋白由于具有良好的生物相容性、弱抗原性和可生物降解性等优良特性,而在医药卫生等诸多领域有广泛的应用。本文在本实验室已成功构建的表达类人胶原蛋白的重组毕赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9KG6的基础上,用响应面分析法(RSM)优化了其在摇瓶培养中的发酵条件。采用Box-Behnken Design(BBD)考察初始诱导pH值、温度和甲醇添加量三个主要影响因子对产物类人胶原蛋白表达量的影响。响应面分析确定的最优因素水平组合为:初始诱导pH值为4.7,温度28℃,甲醇添加量为2.1%/24h。在此基础上利用Bioengineering KLF2000,3.7L自控发酵罐构建了毕赤酵母工程菌株的补料-分批发酵过程菌体的非结构生长模型、产物形成模型、限制性底物甘油和甲醇的消耗模型,为优化发酵工艺控制策略提供理论依据。利用离子交换层析和凝胶过滤层析对发酵产物进行组合分离纯化,得到电泳纯表达产物,通过紫外光谱和红外光谱的谱图分析,表明...  (本文共69页) 本文目录 | 阅读全文>>