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牛传染性鼻气管炎PCR诊断方法的建立及初步应用

本研究根据已发表的IBRV gI基因序列,设计并合成一对特异性PCR引物:P_1 5,GAGGAAGAGGAGGAGTTTGACG—3 P_25-AGCCGCAAATAACACGGTGTGC-3。优化了PCR反应条件,并进行了初步应用。结果表明,优化PCR反应条件为:最佳变性温度为94℃,最佳退火温度为56℃,最佳循环次数为35个循环。PCR系统组成优化结果为:最佳引物浓度为25pmol,最佳dNTP用量为2ul,最佳DNA Taq聚合酶用量为1 unit,最佳Mgcl_2浓度为3.0mM。应用该PCR扩增体系可扩增出IBRV的450bp特异性核苷酸片段,与理论设计扩增片段大小相符。而应用该PCR扩增体系进行牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒的扩增,未见阳性结果。说明该PCR扩增体系具有很好的特异性。该PCR扩增体系可检测出10~(-6)稀释的模板,说明该PCR扩增体系具有较高的敏感性。将该PCR扩增体系进行临床初步应用,  (本文共26页) 本文目录 | 阅读全文>>

集美大学
集美大学

牛传染性鼻气管炎和赤羽病分子检测方法的建立和应用

牛传染性鼻气管炎(IBR)和赤羽病(AKA)是两种重要的危害养牛业的病毒性传染疾病,曾给养牛业带来巨大的经济损失,我国进出口境牛及其相关产品大多要求对这两种疫病进行检疫。目前检测IBR和AKA的方法主要有免疫荧光抗体试验、中和试验、酶联免疫吸附试验、电镜技术和胶体金等技术,这些方法对检测IBRV和AKAV起到了重要作用,但同时也存在特异性不强、灵敏性差、耗时长等缺点。迫切需要建立早期的快速、准确的牛病诊断方法,以预防和清除该类传染病隐性感染,确实保护我国畜牧业的健康快速发展。本研究成功建立了检测牛传染性鼻气管炎(IBR)和赤羽病(AKA)的快速检测体系,包括多重PCR、基因芯片和荧光定量PCR法,并优化了一系列反应条件,建立了相应的检测试剂盒,大大加快了牛传染性鼻气管炎(IBR)和赤羽病(AKA)的检测速度并提高了灵敏度。现将所做工作介绍总结如下:(1)双重PCR检测体系。根据牛疱疹病毒1型(BHV1)gB基因序列和赤羽病病毒(...  (本文共62页) 本文目录 | 阅读全文>>

中国兽医药品监察所
中国兽医药品监察所

牛传染性鼻气管炎的快速诊断

对牛传染性鼻气管炎(IBR)的诊断,现有的国家标准规定为血清中和试验,由于该试验操作复杂,费时长、成本高,基层兽医难以采用。为了解决IBR的快速诊断问题,本研究试图采用PCR方法对牛传染性鼻气管炎进行快速的病原学诊断,研制间接ELISA试剂盒对牛传染性鼻气管炎进行快速血清学诊断。根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列,合成了两条引物,优化了反应条件,分别对IBRV的Bartha Nu/67株,IBRV-BK125株DNA模板进行扩增,结果对两株IBR病毒DNA均可扩增出362bp的特异性片段;对伪狂犬病毒(PRV)、火鸡疱疹病毒(HVT)及牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行扩增均未见特异性条带。灵敏性检测表明,该PCR方法对IBR病毒的检出限量为711TCID50。以IBR山羊肾细胞病毒液作为包被抗原,建立了检测IBRV血清抗体的间接ELISA方法,并确定了抗原包被稀释度、血清稀释度、鼠抗牛IgG单抗稀释度、血清作用...  (本文共54页) 本文目录 | 阅读全文>>

石河子大学
石河子大学

牛副流感病毒3型HN基因—牛传染性鼻气管炎重组病毒的构建与鉴定

牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)和牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus 3,BPIV3)均为牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)的重要病原。牛呼吸道疾病综合征是一个严重阻碍世界养牛业健康发展的疾病,具有很高的感染率和死亡率。IBRV是双链DNA病毒,基因组为130 kb左右,可允许外源基因插入,是重组活载体疫苗的候选病毒载体,已有很多外源病毒基因成功地插入到了IBRV基因组中。牛副流感病毒3型,是引起犊牛肺炎的主要病原之一,引起的感染在世界范围内流行。牛副流感病毒3型的HN基因是病毒主要的诱导中和抗体的保护性抗原,被广泛应用于疫苗研究,如重组腺病毒载体疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗及纳米颗粒疫苗。因此,构建携带BPIV3 HN基因的重组IBRV活载体疫苗,...  (本文共106页) 本文目录 | 阅读全文>>

吉林大学
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牛传染性鼻气管炎(IBR)快速筛查方法的建立及应用

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)具有广泛的组织嗜性,侵害的组织不同而表现出不同的临床症状,如鼻气管炎型、生殖道感染型、结膜炎型和脑膜脑炎型等。IBR在临床上常呈隐性感染并持续性排毒,给全球的养牛业造成很大的经济损失,世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告性动物疫病,我国也将其列为进出口牛的检疫疾病之一。IBRV基因组编码11种糖蛋白,其中gB蛋白是病毒囊膜表面展示的主要蛋白之一,也是主要的免疫原蛋白,在病毒致病过程和刺激机体产生抗体过程中均起较大的作用。本研究根据GenBank已公布的IBRV Bartha Nu/67株基因序列,利用生物学软件DNASTAR对gB基因进行分析,同时参考相关资料,找出gB基因组上的5个抗原位点,利用生物学软件Primer Premier 5.0设计6对引物,其中两对引物(内引物和外引物)为采用嵌套式PCR整体扩增IBRV gB基因的引物,另外4对为扩增5个抗原位点的引物。在内引物和扩增5个抗原...  (本文共164页) 本文目录 | 阅读全文>>

扬州大学
扬州大学

应用多重PCR方法鉴定粪样和食品中产气荚膜梭菌及肠毒素阳性产气荚膜梭菌的基因型鉴定

产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病的病原体,广泛存在于环境中的土壤、水源、人和动物肠道中。根据产气荚膜梭菌产生的四种主要致死性毒素(α、β、ε、τ毒素)可将产气荚膜梭菌分为五种类型,即A、B、C、D、E型。产气荚膜梭菌的经典分类方法,通常采用动物中和试验,该方法操作繁琐、费时,而且有的结果不准确。文其乙等成功建立了一种快速基因分型的多重PCR方法。该方法可以在一个PCR反应中,同时扩增出四种主要毒素的基因片段,根据各种毒素基因的PCR产物来判定产气荚膜梭菌的菌型。ε毒素PCR产物为665bp,τ毒素PCR产物为446bp,α毒素的PCR产物为324bp,β毒素的PCR产物为196bp。另根据最新发现的另二种重要致病性毒素——肠毒素(Enterotoxin,CPE)和β_2毒素——基因的序列设计了引物,与以上四种分型毒素基因PCR引物相结合,构建改良的分型PCR方法。从多重PCR反应得到了CPE的PCR产物为233bp,β_2毒素...  (本文共47页) 本文目录 | 阅读全文>>

湖南农业大学
湖南农业大学

日本柑桔黄龙病菌电镜观察及PCR检测

柑桔黄龙病是由韧皮部杆菌Candidatus Liberibacter引起的一种柑桔毁灭性病害,在多个国家与地区均有发生。该病在日本1988年于冲绳县西表岛初次发现,随后河野于1994年在冲绳本岛发现该病并确认,近年来在日本有向北扩展的趋势,最近在鹿儿岛县奄美大岛也有发现。自1970年Bove等用电镜观察到柑桔黄龙病病原以来,电镜观察一直是作为一种重要的鉴定和诊断手段,后来基于扩增16S rDNA特异性片断的PCR检测方法成了柑桔黄龙病检测的主要方法。由于柑桔黄龙病病原只存在于韧皮部筛管细胞中,而对柑桔叶片维管组织固定比较困难。本研究通过对材料细切,小心去掉木质部部分以便于固定。由于植物组织中都含有一定的空气,致使树脂不能顺利浸润细胞器,这就给材料包埋带来困难,这可以通过在预包埋过程中处以真空处理以抽出植物组织中的空气,以便更好包埋。本研究对日本柑桔体内的柑桔黄龙病原菌的形态结构进行了电镜观察,并与发生在其它地区的柑桔黄龙病的病...  (本文共50页) 本文目录 | 阅读全文>>