分享到:

粗糙脉孢菌一种新植酸酶基因的克隆、鉴定和重组酶的生化特性

植酸酶(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase; EC3.1.3.8)能水解催化分解植酸生成无机磷酸和肌醇。植酸酶可分解植物来源饲料中的植酸生成无机磷酸,从而有利于动物对磷元素的吸收,并可减轻磷元素对环境的污染。本论文首次鉴定了粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)植酸酶基因及其重组植酸酶的生化特性。通过序列比对,发现在N. crassa基因组中有一长为1507bp的编码基因与黑曲霉、无花果烟曲霉、土曲霉等微生物植酸酶基因的植酸酶编码基因有一定的同源性,且该基因的结构基因中含有微生物植酸酶常有的活性中心保守序列RHG×R×P。通过PCR扩增出其结构基因,PCR产物经EcoR I酶切后插入表达载体pYX212,得到正向连接产物pYX212-phy,转化酿酒酵母S. cerevisiae W303-1A,得到胞内表达植酸酶的酿酒酵母重组菌,鉴定该基因为植酸酶基因。将N.  (本文共47页) 本文目录 | 阅读全文>>

中国农业科学院
中国农业科学院

动物布鲁氏菌感染重组酶聚合酶扩增检测方法的建立

布鲁氏菌病是一个世界性分布的人畜共患病,能够引起多种动物流产和胎儿死亡,对畜牧业造成很大的经济损失。但目前尚缺少一种快速、灵敏的检测方法用于布鲁氏菌病诊断。本试验以布鲁氏菌的bp26基因为靶基因,建立了实时重组酶聚合酶扩增(RPA)方法,并检测了不同家畜样品中的布鲁氏菌。本试验建立的RPA方法在40 ~oC条件下反应20 min,可检测到4个拷贝的含有目的片段的重组质粒。该RPA检测方法的灵敏性为94.9%,特异性为97.0%,分别略低于荧光定量PCR的91.5%和98.5%,但高于普通PCR的93.2%和97.0%。将临床样品分别用虎红平板凝胶试验与RPA方法检测,阳性检出率分别为55.6%和62.2%。该RPA方法与流产衣原体、刚地弓形虫和鼠伤寒沙门氏菌无交叉反应,说明特异性良好。本试验建立的RPA检测方法为下一步研制动物布鲁氏菌的临床检测试剂盒奠定基础。进一步,本试验将快速侧流式试纸与SYBR green I重组酶聚合酶扩...  (本文共87页) 本文目录 | 阅读全文>>

江苏大学
江苏大学

重组酶的设计合成、分离纯化及固定化

作为一种天然催化剂,酶在催化过程中具有高底物特异性、高产物特异性和高催化效率等特点。然而,在酶较为复杂的分离纯化过程中,易失活以及无法回收再利用等缺点也严重限制了其在工业应用的发展。以克服上述酶的缺陷并发挥酶的优异性能为目的,本研究提出了一种高效的分离纯化及固定化的集成化方法来实现这一目的。构建并表达了两种含有融合蛋白标签的β-葡萄糖苷酶(GLEGB,GLEH)。一方面利用ELP标签的温度响应行为,实现目标酶分子的一步快速分离纯化;另一方面利用GB、His标签来强化目标酶在载体材料上的固定化。具体内容如下:(1)设计并通过全基因合成了由ELP纯化标签和石墨烯结合多肽标签的双标签重组β-葡萄糖苷酶质粒pET-GLEGB,由ELP标签和6His标签组成的的二元标签重组β-葡萄糖苷酶质粒pET-GLEH。通过双酶切及PCR验证后证明了重组质粒被成功构建,通过基因测序得到了正确的DNA序列。(2)将β-葡萄糖苷酶转入到受体菌BL21中并...  (本文共78页) 本文目录 | 阅读全文>>

江南大学
江南大学

Humicola insolens角质酶在Escherichia coli中的重组表达、发酵优化及其应用

角质酶是一种多功能水解酶,能够水解短链或长链脂肪酸酯和甘油三酯,也可用于降解植物的多聚体角质,是棉织物生物精炼工业中的重要酶类。本研究首先将特异腐质霉来源(Humicola insolens,H.insolens)的角质酶基因(hic)在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中进行重组表达,研究其酶学性质;再通过3-L罐水平上的发酵优化,进一步提高该重组酶的表达水平;最后,对重组酶在棉织物生物精炼中的应用进行条件优化。主要研究结果如下:1.实现了H.insolens来源的角质酶基因在大肠杆菌中的克隆表达。构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)//hic,将重组菌在摇瓶中培养24h,发酵上清液中的角质酶活性为170 U·mL-1。通过硫酸铵沉淀、阳离子交换柱对重组角质酶进行纯化,考察其酶学性质。结果表明,重组酶的最适反应温度为80℃、最适pH为8.5;在80℃、pH 8.5条件下,重组...  (本文共54页) 本文目录 | 阅读全文>>

华东师范大学
华东师范大学

人源CYP3A4和CYP2J2重组酶表达及其相关代谢研究

CYP450酶(Cytochrome P450,CYP450)是含有亚铁血红素的一类蛋白质超家族,代谢临床上近75%的药物。CYP450重组酶作为药物研发和安全性评估十分重要的体外模型,在CYP450酶介导的药物代谢及药物相互作用研究中起着不可替代的作用。然而,现有CYP450重组酶表达系统均存在一定的缺陷,如蛋白修饰机制简单、成本高、培养周期长等。因此,本研究为克服上述缺陷,以果蝇表达系统构建了高效稳定、操作简便地表达CYP450重组酶的方法。本论文选取CYP3A4和CYP2J2作为代表以期成功构建人源CYP3A4和2J2重组酶。我们通过构建重组表达质粒、以稳定转染和杀稻瘟菌素筛选的方式得到多株稳转细胞:CYP3A4、CYP2J2、OR 和 CYB5A 单转细胞株,OR/CYP3A4/CYB5A 和OR/CYP2J2/CYB5A共表达细胞株。然后,我们对诱导剂及浓度、血红素添加量等影响蛋白表达的条件进行了优化,随后选择阳性细胞...  (本文共107页) 本文目录 | 阅读全文>>

天津大学
天津大学

基于Phi29 DNA聚合酶和Cre重组酶的环状DNA分子等温扩增

等温扩增是在恒定温度下对核酸分子进行扩增,相比PCR等传统的体外扩增方式,其对设备的要求低、低能耗、反应时间短、更能满足简单操作的需求,而广泛应用于临床诊断、即时诊断、全基因组扩增、单核苷酸多态性分析等领域。在当前主要的等温扩增方法中,滚环扩增(Rolling circle amplification,RCA)由于操作简单,扩增速度快,而备受关注。本文利用RCA和位点特异性重组研究在体外扩增环状DNA分子,不同于传统等温扩增的线性产物,其产物为环状分子,对完善现有等温扩增体系具有重要的意义。在制备反应所需酶的过程中,摸索了Phi29 DNA聚合酶、归巢内切酶I-HmuI、Cre重组酶等蛋白的表达条件,发现诱导温度和IPTG浓度会显著影响蛋白的表达情况,降低温度和IPTG浓度会增加蛋白的可溶性表达。以此为基础,通过大量的实验确定了Phi29 DNA聚合酶、I-HmuI、Cre重组酶等13种蛋白的适宜表达条件。依照适宜的表达条件扩大...  (本文共100页) 本文目录 | 阅读全文>>