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黄瓜花叶病毒dsRNA的研究

Double stranded RNA(dsRNA)是植物RNA病毒复制过程的中间产物,这些dsRNA的大小对应于RNA病毒的基因组,而正常的植物组织不含有或仅产生小分子量的dsRNA,因此可通过提取dsRNA对该类病毒进行检测、鉴定等方面的研究。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是一个典型的三分体正链RNA病毒,由于寄主范围广,危害大,并且易于接种,而一直被作为病毒模式种来研究。本文用CMV做为研究对象来探索dsRNA提取的条件;利用dsRNA技术分析该三分体病毒的各基因组在复制过程中的时序变化;同时用CMV卫星RNA的高拷贝特性,以获得高得足够的dsRNA,用来制备dsRNA抗体。研究分为三个部分。本文依据CMV在烟草等系统寄主上的快速复制和高拷贝特性探讨了不同条件对dsRNA提取效果的影响,总结了提取dsRNA的优化条件。结果显示:1)在17%乙醇浓度提取dsRNA的效果最好;2)植物的生长  (本文共72页) 本文目录 | 阅读全文>>

浙江大学
浙江大学

黄瓜花叶病毒卫星RNA人工突变体的构建与稳定性研究

随着新的RNA病毒的不断出现,人们对RNA病毒的适应性变异问题越来越关注。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)卫星RNA作为一类与植物病毒相关的特殊的RNA因子,是基因组最小、生物学功能最简单的分子体系,因而被越来越多的研究者用作研究RNA病毒变异的良好模型。本研究通过卫星RNA的基因克隆和序列比较,利用体外转录和体外重组技术的建立,并通过构建卫星RNA人工突变体,实现了卫星RNA基因变异规律和进化趋势的摸索。研究结果如下:在杭州郊区田间的辣椒植株上分离获得了2株CMV毒株,经dsRNA分析发现均具有典型的卫星RNA条带,并通过RT-PCR获得卫星RNA的全序列。经过序列分析,发现来自HZ03P09分离物的satC336由336个核苷酸组成,来自HZ03P10分离物satC382由382个核苷酸组成。对47个来自不同地区和寄主来源的卫星RNA序列进行同源性分析,发现CMV卫星RNA的序列同源性与地区...  (本文共86页) 本文目录 | 阅读全文>>

石河子大学
石河子大学

新疆加工番茄抗黄瓜花叶病毒转基因技术的研究

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是典型的+ssRNA病毒,是寄主最多、分布最广、对经济作物危害最为严重的植物病毒之一。该病毒为三分体病毒,基因组分布在3条RNA分子上,同时也是研究RNA病毒在寄主上致病机制的模式病毒之一。黄瓜花叶病毒是造成新疆加工番茄减产甚至绝产的重要病原,对于传统的抗病毒育种以及农药防治等方法不仅造成了环境污染,而且费时费力。但是RNAi技术拥有与传统的基因研究方法所不具备的优势,它为研究基因功能及植物基因表达调控提供了新途径,可通过有选择地抑制外源基因的表达,因此在病毒和病虫的防治方面展现了其独特之处。本研究采用RT-PCR的方法扩增黄瓜花叶病毒加工番茄NS04分离物的3个基因组部分序列,利用基因系统进化树分析发现基因组编码的四个蛋白:CMV-1a与日本的毒源AB179764同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%和98.6%:CMV-2a与中国浙江的DQ41273...  (本文共55页) 本文目录 | 阅读全文>>

湖南农业大学
湖南农业大学

利用dsRNA诱导烟草抗黄瓜花叶病毒病的研究

本研究以在植物体内转录出RNA沉默的高效诱导因子—双链RNA(dsRNA)为目标,将黄瓜花叶病毒(CMV)移动蛋白基因(MP)以反向重复的方式与外壳蛋白基因(CP)相连,并定向插入到植物表达载体pBIN438上35S启动子下游;以农杆菌介导法转化烟草,获得34株转基因烟草,并对这转基因烟草进行了抗CMV的研究。根据分子克隆等方法构建得到具有反向重复MP基因的质粒P-M,用XbaI和BamhI双酶切,电泳割胶回收约2200bp大小的短片段,并与同样XbaI和BamhI双酶切后且已去磷酸化的pBIN438连接,鉴定筛选得到含有CMV MP基因的反向重复植物表达载体pBIN-CMV MP(i/r)。用三亲交配法将植物表达载体pBIN-CMV MP(i/r)转入根癌农杆菌EHA105菌株中,经鉴定的阳性转化子用于烟草转化。烟草转化采用农杆菌介导法,将含pBIN-CMV MP(i/r)基因的农杆菌与烟草叶盘共培养,经卡那霉素抗性筛选获得转...  (本文共51页) 本文目录 | 阅读全文>>

石河子大学
石河子大学

黄瓜花叶病毒生物学特性及分子变异研究

目的:CMV是植物寄主最广泛的植物病毒,严重影响新疆农作物的生产。本文以新疆伊宁和石河子地区采集的加工番茄为主的几种蔬菜为实验材料,从血清学水平、分子水平上阐述CMV在新疆的侵染率、株系分化、重组等分子变异,并从分子水平阐述其卫星RNA的分子变异。同时对部分样品进行CMV的分离纯化,然后对它的生物学特性及分子变异进行研究。最终从生物学、基因组水平上系统阐述新疆地区CMV的株系分化、重组等分子变异,为今后新疆地区培育抗CMV植株提供理论依据。方法:本研究从石河子蔬菜研究所采集南瓜和加工番茄样品中提取dsRNA,以dsRNA为模板利用RT-PCR方法扩增CMV卫星RNA序列和CMV RNA3序列;从新疆石河子和伊宁地区采集了加工番茄、辣椒、番茄、南瓜样品,用CMV亚组型抗体DAS-ELISA和CMV亚组Ⅱ型抗体DAS-ELISA检测;在昆诺藜上单斑分离纯化CMV,并接种植物观察其生物学特性;以RNA为模板采用One-stepRT-P...  (本文共87页) 本文目录 | 阅读全文>>

中国农业大学
中国农业大学

黄瓜花叶病毒外壳蛋白负调控病毒茎尖侵染的分子机制

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)在全球范围内分布广泛,能够在作物、观赏植物、蔬菜等单子叶或双子叶植物上引起严重的病害。CMV编码的外壳蛋白(coat protein,CP)以及沉默抑制子2b都是多功能蛋白,主要参与病毒运动和症状决定等致病过程。本研究前期实验发现,野生型CMV(CMVWT)在侵染初期进入寄主顶端分生组织,在侵染后期逐渐在茎尖消失,随后新生叶片出现“症状恢复”的现象。然而,突变体病毒CMVRA(CP的N端R13RRRPRR19突变为连续的A)会持续地侵入茎尖并在顶端组织中积累较高的水平,导致寄主顶端优势的丧失。在寄主顶端组织中,CMVWT比CMVRA诱导更强的RNA沉默,暗示RNA沉默参与CP负调控CMV茎尖侵染过程。本研究首先利用瞬时表达系统,观察到2b蛋白能够抑制GFP诱导的RNA沉默,CPWT共表达能显著减弱2b的抑制效果,而CPRA对2b的抑制能力没有显著影响。GFP mR...  (本文共130页) 本文目录 | 阅读全文>>