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人胰岛素原基因非β细胞表达质粒的构建与包装

前言1型糖尿病是一种受多基因调控,以胰岛素缺乏及高血糖为主要特征的自身免疫性疾病。目前的治疗手段主要是外源性胰岛素替代治疗,但每日注射胰岛素除给患者带来痛苦和不便外,还可导致严重低血糖。近年来,分子生物学尤其是重组DNA技术不断发展,由于糖尿病是因单一组分胰岛素缺乏引起的,且糖尿病患病率较高,使之成为基因治疗研究的热点之一。本实验在前人将furin酶识别序列引入人胰岛素原基因并在其上游连接两个调控元件的基础上,采用定点突变技术,将人胰岛素原基因B链10位组氨酸突变为天冬氨酸,以增加成熟胰岛素的稳定性和产量。随之将携有调控元件的突变胰岛素原基因导入逆转录病毒载体,构建逆转录病毒重组质粒,并采用脂质体转染法将重组质粒导入PA317包装细胞系,采用NIH3T3细胞测定病毒滴度,筛选出一株高效特异的产病毒细胞克隆,为下一步的细胞和动物实验打下基础,从而为糖尿病基因治疗最终应用于临床做基础性的铺垫。实验材料与方法一、诱导人胰岛素原基因B链  (本文共49页) 本文目录 | 阅读全文>>

《江西农业大学学报》2014年02期
江西农业大学学报

重组人胰岛素原基因高效表达和纯化的研究

克隆人胰岛素原基因,通过密码子优化和融合蛋白化学水解位点和纯化标签优化,构建人胰岛素原高效原核表达系统,为重组人胰岛素原的高效表达纯化制备奠定基础。根据大肠杆菌密码子偏好性优化设计人胰岛素原基因,通过PCR技术...  (本文共4页) 阅读全文>>

《食品与生物技术学报》2016年07期
食品与生物技术学报

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的可溶性表达及分离纯化研究

根据NCBI中的人胰岛素原基因序列及大肠杆菌密码子偏爱性设计特异引物,PCR扩增得到人胰岛素原基因,构建该基因的原核表达质粒p ET32-PI,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。对重组菌进行温度和IPTG浓度优化,发现重组菌在30℃和终浓度为0.6 mmol/L的IPTG条件下表达效...  (本文共7页) 阅读全文>>

《第三军医大学学报》2004年19期
第三军医大学学报

人胰岛素原基因突变体的构建

目的 完成人胰岛素原基因的定点突变 ,使之能在普通细胞中被Furin蛋白酶识别去除C肽分泌成熟胰岛素。方法 采用PCR体外定点突变技术 (PCRsite directedmutagenesis ,PCR SDM) ,设计 4对引物 ,引入 5个Furin识别的突变位点 ,...  (本文共3页) 阅读全文>>

中国医科大学
中国医科大学

重组人胰岛素原基因在培养的大鼠肝癌细胞中基因转移和表达的研究

前言1型糖尿病(T1DM)是一种由于胰岛β细胞的自身免疫性损伤导致胰岛素分泌的绝对缺乏,而引起的代谢障碍性疾病。由于其是单一蛋白质—胰岛素缺乏所致的代谢障碍,从而成为基因治疗的适应症。通过基因转移技术将人胰岛素原基因导入糖尿病患者体内,以产生长期、稳定、按生理模式分泌的胰岛素,从而达到永久治疗的目的。但是该基因转入糖尿病患者体内或动物体内之前,必须在体外证明该重组人胰岛素原基因具有长期、稳定、按生理模式调节胰岛素分泌的能力。本实验通过把含重组人胰岛素原基因的质粒以逆转录病毒为载体转入大鼠肝癌细胞CBRH7919,筛选出含有重组胰岛素原基因的肝癌细胞,并检测该种细胞转染后38h及转染后1个月在不同葡萄糖浓度下其胰岛素的分泌情况。为下一步的动物水平实验打下基础。本实验的目的是:1 掌握细胞培养、复苏及冻存技术。2 掌握基因转染技术及鉴定方法。3 测定不同葡萄糖浓度下肝癌细胞在转染后38h及稳定表达后胰岛素的分泌情况。4 掌握...  (本文共42页) 本文目录 | 阅读全文>>

《生物化学杂志》1987年02期
生物化学杂志

人胰岛素原基因在酵母中的分泌表达

我们研究了外源基因——合成的人胰岛素原基因在酵母α因子系统中...  (本文共6页) 阅读全文>>