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利用重组菌不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯

R-(+)-4-氯-3羟基丁酸乙酯(Ethyl R-4-chloro-3-hydroxybutyrate,(R)-CHBE)是L-肉毒碱、阿伐他汀钙和(R)-γ-氨基-β-羟基丁酸(GABOB)等多种药物合成的重要手性中间体,具有重要的应用价值。由于酶催化还原COBE获得(R)-CHBE的过程需要辅酶NADPH参与,为了实现辅酶再生,本文首先从赭色抛孢酵母细胞中克隆到了醛基还原酶(NADPH-dependent aldehyde reductase, ALR)基因,并且从巨大芽孢杆菌中克隆出6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,gdh223)基因,构建了具有高还原速率和手性选择性的重组大肠杆菌E. coli M15(pQE30-ALR-gdh223)。优化其还原反应条件,结果表明,100g/L重组菌在32℃,以150mM的葡萄糖为辅助底物的缓沖溶液(pH6.0)中能将30mM的  (本文共73页) 本文目录 | 阅读全文>>

华南理工大学
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重组E.coli_CtSAPDH细胞催化生物基呋喃醛选择性氧化的研究

糠醛和5-甲氧基甲基糠醛(5-methoxymethylfurfural,MMF)是重要的生物基平台化合物,可以由碳水化合物脱水制备得到。MMF及糠醛中均含有甲酰基,可分别被选择性氧化成5-甲氧基甲基-2-糠酸(5-methoxymethyl-2-furancarboxylic acid,MMFA)及糠酸。这两种产物是制备香料、药物、农业化学品、光电材料及合成纤维的重要中间体。目前,化学法仍是合成MMFA和糠酸的主流方式,但该法存在环境不友好、选择性欠佳、能耗高及反应条件苛刻等问题。而生物催化能有效解决上述问题,符合绿色可持续的发展理念,有望取代化学法用于糠酸及其类似物的合成。最近本实验室分离得到一株可高效催化5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl-furfural,HMF)氧化的Comamonas testosteroni SC1588,随后从中发掘出一个可高效催化HMF氧化的3-琥珀酰半醛-吡啶脱氢酶(3-succi...  (本文共104页) 本文目录 | 阅读全文>>

江南大学
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Pantoea dispersa蔗糖异构酶在芽孢杆菌中的表达及发酵优化

蔗糖异构酶(Surcose Isomerase,SIase)能将蔗糖分子内的α-1,2-糖苷键转位形成α-1,6-糖苷键或α-1,1-糖苷键,从而得到异麦芽酮糖或海藻酮糖,根据其主产物不同也被称作异麦芽酮糖合酶或海藻酮糖合酶。异麦芽酮糖与蔗糖在甜度、溶解度等物理性质比较相近。相对于蔗糖而言,异麦芽酮糖具有防龋齿、预防糖尿病、抗疲劳、易吸收等特点。生物酶法制备异麦芽酮糖转化率较高,反应条件温和,产物易分离,符合绿色环保的要求。本研究基于前期构建的产蔗糖异构酶重组菌Brevibacillus choshinensis/pNCMO2-SI,通过对摇瓶和3-L罐培养条件进行优化,并进一步筛选启动子提高了酶产量。同时将蔗糖异构酶基因在宿主菌Bacillus subtilis WSH11中进行表达,同时比较两个表达系统的优劣性。主要研究结果如下:(1)通过摇瓶优化,确定了重组菌B.choshinensis/pNCMO2-SI最佳培养条件为:...  (本文共54页) 本文目录 | 阅读全文>>

江南大学
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Athrobacter ramosus的MTSase和MTHase的重组表达及应用

海藻糖是一种天然低聚二糖,是许多植物、昆虫和微生物在逆性环境下的应激代谢物,具有低卡、稳定、保湿和防晒等优点,广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。海藻糖主要是以淀粉为底物经麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC5.4.99.15)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl trehalose trehalohydrolase,MTHase,EC3.2.1.141)连续作用获得,但是目前报道的这两种酶的表达宿主大多为大肠杆菌,其含有的内毒素不利于食品酶的制备,而枯草芽孢杆菌不分泌内毒素,且发酵周期适中、培养方便,是食品级酶制剂表达宿主的最佳选择之一。本实验室前期构建了重组表达Athrobacter ramosus S34来源的MTSase和MTHase的B.subtilis WS11/pHY300PLK-Y和B.subtilis WS11/pHY300...  (本文共53页) 本文目录 | 阅读全文>>

江南大学
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双基因共表达策略对高山被孢霉重组菌合成EPA的作用研究

二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)是一种ω-3系列长链多不饱和脂肪酸,具有抗凝血、预防心血管疾病、降血脂等特殊生理功能,在保健品、食品和饲料行业均有较多的应用。产油微生物高山被孢霉(Mortierella alpina,M.alpina)已用于工业化生产花生四烯酸(Arachidonic acid,AA),其AA产量约占总脂肪酸的50%,常温条件下不产EPA,低温条件下EPA产量仅占总脂肪酸含量的2%左右。ω-3脂肪酸脱饱和酶具有催化AA生成EPA的作用,是ω-3长链多不饱和脂肪酸合成途径中的关键酶。本实验室前期成功将来源于寄生疫霉的脂肪酸脱饱和酶oPpFADS17在高山被孢霉中进行表达,重组菌中EPA含量显著提高。而还原力NADPH在脂肪酸合成过程中起关键作用,实验室前期成功将产生还原力的关键基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2在高山被孢霉中进行了表达,重组菌中总脂肪酸含量得到提升。本文为了同步...  (本文共53页) 本文目录 | 阅读全文>>

广西大学
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产降氰酶重组菌BL21-pET28a-cdE的氰代谢及特性研究

来自腈超家族的氰水解酶和氰水合酶均可水解HCN,氰水解酶的水解产物为甲酸和氨,而氰水合酶的水解产物为甲酰胺。因产物低毒,可进一步转化,不需要辅助因子和酶活高的优点,二者是最引人关注的氰化物降解酶。本实验前期得到一株克隆于产碱杆菌DN25降氰酶基因的重组菌BL21-pET28a-cdE,已经证明其降氰酶催化水解KCN的产物有甲酸、甲酰胺和氨,同时具有氰水解酶与氰水合酶的功能。本文在前期实验的基础上进一步探讨其催化功能。首先,我们研究了重组菌BL21-pET28a-cdE的稳定性、酶纯化以及添加稳定剂对酶保藏的影响,结果显示,重组菌BL21-pET28a-cdE在无抗生素压力下,传150代后质粒丢失了 34%,但在蛋白表达水平上仍与原代保持同一水平,且菌落形态与原始形态完全一致,其降氰酶酶活力与原代相比保留有99%。经过改善纯化方法,经三步梯度洗脱法镍柱纯化得到单一条带的目的蛋白(约38 kDa)。确定了 cdE纯酶的最适反应条件为...  (本文共77页) 本文目录 | 阅读全文>>